福建省蛇源蛔虫cox1 基因扩增与种系遗传发育分析

黄潇航，王诗晨，李诗艺，贺金峪，张 龙，宋肇程，黄志坚，殷光文

（1.福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建福州 350002；2.福建省动物药物工程实验室，福建福州 350002；3.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350013）

线虫为临床危害较大的寄生虫类群，蛔虫归属其中。动物蛔虫病的发生会降低动物的生产性能，影响膘情、生长发育等多方面的机体功能。在医学临床上，蛔虫幼虫在肠道发育阶段会发生肺、肝等部位的蚴虫移行症状，造成宿主的机械性损伤甚至死亡。蛇蛔虫病是由蛇蛔虫引起的寄生虫病，主要导致蛇群出现消化系统症状，多量寄生时会造成蛇群生长迟缓，甚至死亡。

在对珍稀或者特种经济野生动物疾病防治上，开展蛔虫的种类鉴定、致病危害等方面研究对于蛔虫病临床治疗、疫苗研发等具有非常重要的公共卫生意义。分子生物学鉴定技术近年来逐渐成为物种种类鉴定研究的热门方向，其中细胞色素氧化酶C-I 区片段（cox1）被广泛应用于鸟类、兽类等动物遗传鉴定的重要遗传鉴定区。寄生虫作为地球上存在的较为古老的种群，其种群遗传对于近现代物种演化研究具有非常重要的参考价值。我国在蛔虫种类鉴定上也由传统的形态学观察鉴定逐渐向分子遗传鉴定发展，在猪蛔虫、鸡蛔虫等传统畜禽蛔虫的分子遗传学领域，如nad4、cox3等遗传区间的扩增，已取得了一定的分子数据积累，但在野生动物寄生虫方面的研究较少。

cox1是蛔虫线粒体内的一段具有较高种间保守性且遗传稳定的母源遗传基因片区，目前多项报道支持其在黄鳝胃瘤线虫、狮弓首蛔虫、鸡蛔虫等分子遗传学研究中的重要种类鉴定意义，也被逐渐广泛应用于线虫等蠕虫的种群遗传研究。

2019年底福建省南平市某蛇类养殖场暴发蛇蛔虫病，病蛇表现为消瘦、拒食等症状，剖检后可见肠道及胃部邻界处寄生大量蛔虫。本研究在原先临床案例[1]基础上，对送检的大王蛇体内分离获得的蛇蛔虫进行DNA 提取，使用PCR 扩增和分子测序技术，对cox1基因进行分子鉴定，明确其种属差异性，以期为福建省蛇蛔虫病防治积累相关的基础性研究资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蛇蛔虫虫体，保存于-20℃，70%乙醇溶液中；DNA 提取试剂盒FastDNA SPIN Kit，美国MP Biomedicals 公司生产；EasyTaqMix 聚合酶，全式金生物公司生产；引物JB3.0、JB4.5，上海生工生物工程股份有限公司合成；DNA 胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金生物技术有限公司生产；Veriti 梯度PCR 仪，Applied Biosystems 公司生产；Omega Fluor Plus 蓝光凝胶成像系统，美国Aplegen 公司生产。

1.2 试验步骤

1.2.1 DNA 提取 选取3 条蛇蛔虫雌虫，编号为S1—S3，截取虫体1 cm 头部组织，使用DNA Fast Kit 试剂盒，参照使用说明书对处理后的虫体组织进行DNA 提取，提取后除试验用量之外，将剩余DNA 放入-20℃环境下保存备用。

1.2.2 引物合成 参考文献[2]合成引物序列（表1），由上海生工有限公司合成制备。

表1 引物序列

1.2.3 PCR 扩增 使用PCR 扩增目的片段，使用ddH2O 作为阴性对照。搭配反应体系为25.0 μL：DNA 模板4.0 μL，ddH2O 6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，EasyTaqMix 酶12.5 μL。反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 5 min。为提高PCR 扩增的产物量，将第1 轮获得的扩增阳性条带使用胶回收后获得纯化DNA 模板，开展第2 轮PCR 扩增。

1.2.4 凝胶电泳成像 将扩增后的PCR 产物加入琼脂糖电泳孔中进行电泳，设定电压150 V、电流100 mA，进行30 min 电泳后，将产物移至紫外凝胶成像仪中进行阳性条带观察，并拍照记录。

1.2.5 阳性产物切胶回收 将获得的阳性条带在紫外仪下精准切割后，使用胶回收试剂盒回收纯化产物DNA，送往福州铂尚生物科技有限公司进行产物测序鉴定。测序采用Sanger 双向测序，测序试剂盒为Abi 试剂盒。

1.2.6 纯化产物测序 测序结果返回后，使用DNAstar 7.0 等生物分析软件进行生物遗传碱基序列差异性比对分析。

2 结果与分析

2.1 凝胶电泳成像

从凝胶电泳成像图（图1）来看，使用的DNA Marker 标识度为2 000 bp，获得S1—S3 样品扩增的cox1大小片段在450 bp 左右，作为空白对照的阴性样品无条带产生。

图1 蛇蛔虫的cox1 扩增结果

2.2 DNA 序列分析

对从生物公司返回的S1—S3 序列进行分析比对，发现获得的目的片段大小约443 bp（图2），GC 百分比为35.66%～35.89%。获取测序序列后，将其与NCBI 中登录的物种数据进行比对发现：所获得蛇蛔虫与早前报道于上海的蛇丝状蛔 虫（Ophidascaris filaria，MH285590.1）序 列同源性最高（图3），为99.1%～99.3%；其次为Toxascaris leonina（AJ920063.1）、Baylisascaris columnaris（MH795148.1），同源性分别为90.7%～90.9%、90.8%～91.0%；与其他虫种同源性为87.0%～90.0%，差异较大。结合分子生物学和早前临床形态学观察等结果，表明暴发于福建省南平市某蛇类养殖场蛇蛔虫病的主要致病原为蛇丝状蛔虫。

通过与已登录的蛇蛔虫（MH285590.1，OF）序列进行比较，发现S1—S3 分离株在基因位点遗传上表现为不同基因区的碱基突变（图2）。S1—S3 与OF 存在差异的位点主要表现为3 个位点的碱基突变：依次为11 位点的G-C 突变，68位点T-C 突变，433 位的C-T 突变，其余碱基序列基本相同。借助DNAstar 7.0 中的MeAlign 分析，对参与比对的蛇蛔虫S1—S3、OF 以及鸡蛔虫（KX266846.1）、浣熊贝蛔虫（MH795148.1）、对盲囊线虫（FJ416643.1、FJ866816.1）等虫种序列进行比较，发现S1—S3 序列与OF 具有最高的种间亲缘性，且都超过99.0%，而与对盲囊线虫等的cox1同源性均低于95.0%（图3）。

图3 使用DNAstar 7.0 软件制备的同源性对比结果

2.3 进化树分析

通过序列比对发现，分离自福建省的蛇蛔虫除与现已报道的蛇蛔虫（MH285590.1，OF）同源性为99.1%～99.3%外，与其他已报道的动物蛔虫具有较大的遗传差异性，因此通过Mega7.0 软件将序列裁剪后采用Bootstrap 比对1 000 次，采用Neighbour Joining 方法制备系统进化树。将报道的Strongyloides（LC535118.1）作为构树的遗传外类群，构建了蛇蛔虫种系进化树。树图构建分析结果（图4）显示，分离自南平市蛇类养殖场的分离株S1—S3 在进化树树枝分化上形成聚合分支，且与NCBI 报道的蛇丝状蛔虫聚于一支，与基因同源性分析结果相符合。在外枝周围，蛇蛔虫分支与Toxascaris leonina（AJ920063.1），Parascaris univalens（MK209671.1），Contracaecum rudolphii（FJ866816.1）等近源线虫分散在不同遗传分支且差距较大。综上，本次分离鉴定的蛇蛔虫在分子生物学上属于蛇丝状蛔虫，与其他动物寄生蛔虫具有较大的种间差异性。

图4 蛇蛔虫南平分离株（NJ）进化树

3 讨论

在蛇类线虫分子生物学鉴定方面，关于福建省蛇类寄生虫方面的研究甚少。国际上对蛇蛔虫开展的种类鉴定主要集中在形态学鉴定上[3-4]，也有扫描电镜的相关报道[5]。在相关临床案例中，有报道[6]在患有肿瘤病蟒蛇的胃部分离到蛇丝状蛔虫，这也是为数不多的使用分子诊断技术鉴定蛇蛔虫的案例报道。

cox1本身是一种对于多数线虫都能进行扩增研究的重要母系遗传区间，具有片段小、保守、种间差异显著的特点。国内相关研究多停留在形态学领域上，而使用分子生物学技术研究蛇蛔虫的相关报道较少。通过cox1扩增，对引发蛇场疫情的蛔虫种类进行鉴定，发现3 株蛇蛔虫的cox1同源性为99.5%～99.8%（图3），存在2 处碱基的变化差异，与上海市蛇丝状蛔虫的cox1同源性为99.1%～99.3%，存在较少碱基差异，提示蛇丝状蛔虫地域株在cox1种内遗传差异上较为保守。S1—S3 与鸡蛔虫、对盲囊线虫等线虫同源性低于种间同源性，因而利用cox1能够较好地区别蛇蛔虫。

福建省在蛇类寄生虫病研究方面的报道较少，而本项研究为福建省蛇类蛔虫分子分类鉴定提供了相关佐证，同时进一步验证了细胞色素氧化酶cox1片段具有种间高度保守性，从而说明对该片段的扩增分析能够为蛇蛔虫分子生物学分类鉴定提供有效的辅助手段。