副溶血弧菌T3SS1 VscF蛋白多肽抗体的制备与应用

薛婷月，廉乐乐，李婉君，薛 峰

（南京农业大学动物健康与食品安全国际合作联合实验室，江苏南京 210095）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为革兰氏阴性菌，其感染途径主要是食入生或未烹饪完全的海产品[1]。III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）是高度组织化的多蛋白纳米机器[2-4]，包括结构蛋白、分泌蛋白以及伴侣蛋白等，在多种革兰氏阴性菌致病过程中扮演重要角色。研究发现，多数副溶血弧菌临床分离株含有两套T3SS[5]，包括位于1 号染色体的T3SS1 和位于2 号染色体的T3SS2，其分别表现细胞毒性与肠毒性[6]。T3SS1 是副溶血弧菌的重要毒力因子，但其致病机制尚未被阐明。

T3SS 要将具有毒性作用的效应蛋白输送到细胞内起作用，最关键的一步就是要先分泌并组装成具有运输功能的分泌器装置，且只有与分泌器顶端的两个疏水性转位蛋白结合才能激活输送作用[7]，而针状蛋白在其中扮演着很重要的角色[8-9]。有关学者研究发现，在大多数革兰氏阴性细菌中，菌体可将自身分泌的6 kD 左右的单体针蛋白聚合成细胞外针状组分，从而协助菌体穿透真核质膜而形成效应子易位的分泌管道[10-12]。

vscF基因编码的VscF蛋白是T3SS1 的针状蛋白。本研究利用生物学软件分析预测针状蛋白VscF 线性抗原表位并选择最优多肽序列送至公司合成，然后与具有高度免疫原性的KLH蛋白偶联，制备针对VscF蛋白的特异性多克隆抗体，旨在缩短常规抗原蛋白表达纯化所需时间，获得VscF 特异性多克隆抗体，为后续VscF 相关蛋白互作研究提供必要的抗体基础。

1 材料与方法

1.1 材料

MBS 交 联 剂（Maleimide-benzoic acid Nhydroxysuccinimide ester），购自大连美仑生物技术有限公司；KLH 载体蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin），购自南京伟沃生物科技有限公司；DMF（N，N-二甲基甲酰胺），购自生工生物工程股份有限公司；PD-10 预装柱、ECL 显色液，购自GE Healthcare Life Science；VscF 肽段，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、TMB 单组分显色液、PVDF 膜，均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；HRP-羊抗兔IgG 抗体，购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司；FITC 标记山羊抗兔Ig G（H+L），购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VscF 多肽抗原表位筛选并合成 在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库检索副溶血弧菌VscF蛋白序列ID，并在OptimumAntigenTM软件输入后检索设计VscF 抗原多肽。综合考虑序列长度、亲水性/疏水性、表面定向性、灵活性等因素，选择最优多肽序列送金斯瑞生物公司合成。

1.2.2 MBS 法偶联KLH 载体蛋白制备抗原KLH蛋白溶于10 mmol/L PBS 至终质量浓度为10 mg/mL，4 ℃冰箱透析过夜备用。MBS 溶解于DMF 至终质量浓度为10 mg/mL。KLH 与MBS 以10:1 的体积比混合，室温孵育30 min 后过PD-10层析柱；缓慢加样，PB 缓冲液洗脱，收集活化的KLH 于EP 管中；将多肽溶解于PBS 并等体积与活化的KLH混合，室温孵育3 h，4 ℃透析过夜备用。

1.2.3 免疫新西兰兔制备多克隆抗体 将偶联KLH 的VscF 多肽混合物与弗氏完全佐剂等体积混合，分别皮下注射免疫2 只4 月龄新西兰大白兔，在一免后21、35 d，将制备好的抗原与弗氏不完全佐剂混合进行2 次加强免疫，每次免疫剂量为200 μg/只；三免15 d 后心脏采血，分离血清获取多克隆抗体，测定抗体效价。

1.2.4 间接ELISA 测定多克隆抗体效价 采用间接免疫法检测VscF 抗体效价，将抗原多肽用包被液稀释成4 μg/ mL，每孔100 μL 包被酶标板，4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤3 次，10 min/次；5%脱脂乳室温（25 ℃）封闭2 h，PBST 洗涤3 次，10 min/次；将上述制备的多克隆抗体血清用PBS进行倍比稀释，分别为1:1 000、1:2 000、1:4 000等，混匀后以100 μL/孔加入酶标板中，阴性血清作为空白对照，室温孵育2 h，PBST 洗涤3 次，10 min/次；向每孔中加入100 μL 经1:5 000 稀释的酶标二抗（山羊抗兔-HRP），置于37 ℃恒温箱1 h，PBST 洗板3 次；每孔加入100 μL TMB显色液，置于37 ℃显色 15 min；加入100 μL 2 mol/L HCl 终止反应，即刻在酶标仪上读取OD450吸光值。将阳性OD450/阴性OD450≥2.1（即P/N≥2.1）时所对应的最高稀释倍数作为抗VscF 血清效价。

1.2.5 免疫印迹法检测VscF 多抗特异性 将实验室保存的VscF 原核表达蛋白进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，300 mA 转60 min 至PVDF 膜，将实验室保存的VopS 与CyaA蛋白为阴性对照，后续封闭与洗脱参考抗体效价检测。此处阳性抗体稀释度选择1:2 000，ECL 显色液曝光。

1.2.6 多克隆抗体应用 将副溶血弧菌野生株与ΔvscF缺失株接种至含3%氯化钠的LB 液体培养基，（36±1）℃培养至对数期，1×PBS 洗2～3 次，涂抹到载玻片上，风干，5% BSA 封闭1 h；加入VscF 多克隆抗体（稀释度1:2 000），4 ℃孵育过夜；1×PBS 洗3～5 次，使用FITC 标记山羊抗兔Ig G（H+L）（稀释度1:500），室温孵育1 h；1×PBS 洗3～5 次，使用荧光倒置显微镜观察荧光阳性情况及定位。

2 结果与分析

2.1 VscF 多肽抗原表位筛选

利用OptimumAntigenTM软件分析VscF蛋白序列各参数，发现VscF蛋白的抗原决定簇位于前半段多肽序列，而其他部位为跨膜区域（图1）。分析结果（表1）显示，筛选出3 条多肽，最终选择2 号肽段由相关生物公司合成。

表1 抗原多肽设计结果

图1 VscF蛋白序列抗原表位筛选及相关特性分析结果

2.2 多克隆抗体效价检测

间接ELISA 法检测3 次免疫后新西兰兔血清中的VscF 抗体效价。检测结果（图2）显示，在稀释度为1:512 000 时，P/N（0.363/0.170）＞2.1，表明抗体效价为1:512 000。

图2 抗VscF 血清效价检测结果

2.3 抗体特异性检测

采用Western Blot 法检测血清抗体对原核表达VscF蛋白抗原抗体反应的特异性，经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色，发现1～4 号均有蛋白样品存在（图3-A）；ECL 曝光结果显示，血清抗体1:2 000 稀释后与VscF蛋白发生特异性反应，而其他对照组未出现显色条带（图3-B），表明产生的多肽抗体具有VscF蛋白特异性，能够准确检测VscF蛋白。

图3 VscF 抗体特异性检测结果

2.4 多克隆抗体应用

制备的多克隆抗体可通过免疫荧光来鉴定针状蛋白VscF 在副溶血弧菌野生株（WT）与ΔvscF缺失株中的表达情况。经诱导后的野生株表达针状蛋白VscF 与VscF 多克隆抗体发生特异性反应，可见红色箭头标示的绿色荧光（图4），而对照组ΔvscF则无法检测到绿色荧光，表明VscF 多克隆抗体具有较好的反应性和特异性，可用于针状蛋白VscF 后续研究。

图4 免疫荧光染色测定VscF 多克隆抗体的反应性和特异性结果

3 讨论

副溶血弧菌T3SS1 的研究主要包括效应蛋白与结构组装两个方面。已经发现的效应蛋白有VopQ[13-14]、VopS[15]、VPA0450[16-17]、VopR[18]，其均与细胞毒性有关。目前对T3SS1 特有的注射体结构研究甚少。有报道显示：VopB1（VP1657）、VopD1（VP1656）[19]是与效应蛋白转位相关的结构蛋白；VscI（VP1691）[20]与 YscI/HrpB 家族多个蛋白同源，参与效应蛋白的易位过程；VscF[21]与志贺氏菌MixH、耶尔森氏菌YscF 同源，以单体形式参与组成T3SS1 胞外针状复合体。有报道[22-23]称，耶尔森菌T3SS 针状复合体可为效应蛋白运输提供结构基础。此外：Cao 等[24]在耶尔森菌属中发现，YscI 通过直接与YscF 相互作用参与了针状结构的组装；Souza 等[25]证明，YscF 在细菌细胞质中的稳定与伴侣蛋白YscE和YscG 有关，YscF、YscE 和YscG 形成可溶的异三聚体复合物，可防止YscF 在细菌细胞质内聚合。而副溶血弧菌T3SS1 针状蛋白VscF 特异性多肽抗体的制备，为进一步研究副溶血弧菌T3SS1 针状复合体的分泌组装机制奠定了基础。此方面相关研究比较全面，还包括针状单体蛋白聚合方式、针体尺寸、针体长度调控与分泌诱导方式以及复合体中相关蛋白的互作和整个结构的组装模式预测[26-28]。

制备多克隆抗体通常使用大肠杆菌原核表达系统，对抗原蛋白或者肽段进行表达与纯化[29-30]，后续免疫动物，但是存在实验周期长、蛋白表达不可溶和蛋白纯度低等问题。本研究利用合成多肽制备多克隆抗体，与传统方法相比，既缩短了构建载体与蛋白纯化所需时间，又提高了蛋白纯度。在综合考虑序列长度、亲水性/疏水性、表面定向性、灵活性等因素后，共筛选得到3 条备选多肽序列，其中2 号多肽序列位于N 端，更容易产生高性能抗体。最终生物合成了2 号多肽序列，偶联KLH载体蛋白与免疫新西兰兔后获得多克隆抗体。考马斯亮蓝染色结果表明，多抗纯化效果较好，间接ELISA 效价比达1:512 000，显示出VscF 多肽抗体具有良好的反应性。Western Blot 结果显示，在25～35 kD 有一条特异性条带；免疫荧光染色结果显示，诱导后的野生株表达针状蛋白VscF 可与VscF 多克隆抗体发生特异性反应。

综上所述，副溶血弧菌T3SS1 针状蛋白VscF多肽抗体制备成功，其反应性与特异性均良好，可作为VscF 验证试验中具有特异性结合作用的抗体，这为后续副溶血弧菌T3SS1 装置组装机制过程中的VscF 相关蛋白互作研究提供了抗体基础。