两种禽白血病病毒检测方法的对比

王树艳，沈前程，陈智武，凌 丁，粟永春

（1.广西农业职业技术学院，广西南宁 530007；2.广西金陵农牧集团有限公司，广西南宁 530049）

禽白血病（avian leukosis）是由反录病毒科、禽C型反录病毒群禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，是一种重要的免疫抑制性疫病，可造成感染鸡群免疫抑制、抵抗力降低、生产性能下降等多种危害[1]。ALV 具有垂直传播特性，感染鸡群随着繁育有感染加剧情况[2]。近年来，鸡群ALV 感染和临床暴发次数增加，混合感染严重[3]。

目前防控该病没有有效的疫苗和药物。实施种禽ALV 净化是控制该病的最根本方法。改进ALV 分离过程和提高检出率，能够加快ALV 净化进展，降低企业净化投入，对ALV 净化起到积极的推动作用。ALV 检测的常规法是通过离心分离血浆，然后接种于DF-1细胞来检测的方法，是分离、检测ALV 最准确、最标准的方法[4-5]，而改进法则是通过自然沉淀分离血浆来检测。本试验对比了离心分离和自然沉淀血浆两种方法对DF-1 细胞以及ALV 检出率的影响，以期为提高ALV 检出率提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

随机选择94 只225 日龄某公司淘汰公鸡，每只采集2.0 mL 血液，分别注入2 支肝素钠抗凝管（1.0 mL/管）中，分A、B 两组，颠倒混匀，分别标识（A1—A94、B1—B94）。其中A 组（改进法）抗凝血在室温自然沉淀2 h，B 组（常规法）常规离心，待抗凝血分层后，2～8 ℃冷藏备用。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM高糖培养基（批号8120281），GIBCO 公司产品；胎牛血清（批号20050504），浙江天杭生物科技股份有限公司产品；DF-1 细胞，哈尔滨兽医研究所馈赠；DMSO（批号1029B031），北京索莱宝科技有限公司产品；肝素钠抗凝管（批号191102），江苏康捷医疗器械有限公司产品；禽白血病P27 检测试剂盒（批号JS774），IDEXX 公司产品。

二氧化碳培养箱，BPN150CW（uv）型，上海一恒科学食品有限公司产品；生物安全柜，BSC-1304IIA2型，苏州安泰空气技术有限公司产品；酶标仪，FC型，赛默飞世尔科技有限公司产品；倒置显微镜，BM-37XBC型，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司产品。

1.3 检测方法

1.3.1 样本处理 A 组抗凝血样本在室温条件下静置2 h，B 组样本3 000 r/min，离心5 min，使抗凝血中的血浆和细胞分层。

1.3.2 细胞复苏 从液氮中复苏DF-1 细胞，加入10%胎牛血清DMEM 高糖培养基，放入5%CO2的细胞培养箱中48 h；用5%的胎牛血清培养液调成细胞密度为6×106个/mL 的悬液，接种到96 孔细胞培养板中，100 μL/孔，待细胞贴壁、形态健康、密度合适（70%铺满孔底）时，进行血浆接种。

1.3.3 细胞接种与培养 取出处理后的样本，室温下放置2 h。A 组：吸取样本上清，接种96 孔细胞板中，30 μL/孔，放入37 ℃ 5% CO2培养箱4 h，观察细胞形态后，再加入100 μL/孔的DMEM 高糖培养基，放入37 ℃ 5% CO2培养箱中维持培养7 d；B 组：按常规方法[4]接种96 孔细胞板中，30 μL/孔，放入37 ℃ 5% CO2培养箱中培养4 h，观察细胞形态后，吸去液体，随后用PBS 清洗1 次，每孔加入230 μL 1%胎牛血清的DMEM 高糖培养基（维持液），最后放入37 ℃ 5% CO2培养箱中维持培养7 d。

1.3.4 样本检测 将培养7 d 后的细胞样本，从细胞培养箱中取出，吸出每孔中的上清，再用PBS液清洗2 次/孔；加入PBS 液200 μL/孔，放入-20 ℃冰箱中，待培养液结冰后取出，室温解冻，按该方法进行3 次冻融。按照禽白血病ELISA P27检测试剂操作要求和判定标准，检测培养上清中ALV P27 抗原。

1.3.5 净化 使用改进法在某场的A、B 两个品种鸡群中开展ALV 净化检测。在第一世代产蛋前开展3 次ALV 细胞分毒检测，每品种抽检初产蛋184 枚；在第二世代胎粪、血浆和初产蛋中分别抽检ALV，评估净化效果。

1.4 统计分析

将不同处理方法的检测结果，使用SPSS 软件进行对比分析，以P＜0.05 判定为差异显著，统计结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 细胞培养状态

结果（图1）显示：A 组接种血浆4 h 后，DF-1 细胞间隙扩大，细胞触角明显；B 组细胞间隙均匀，扩大不明显，细胞触角明显。培养7 d 后，A 组细胞呈细丝状，布满孔底，1.0%孔边缘有细胞层脱落；B 组细胞呈细丝状，10.0%孔边缘有细胞层脱落，孔底有小空洞。结果表明，A 组细胞状态优于B 组。

图1 接种后细胞状态（160×）

2.2 P27 抗原检测

统计结果（表1～2）显示：A 组在B 组的阴性样本中检出8 份阳性样本。A 组检出率35.11%（33/94），B 组检出率28.72%（27/94），A 组比B 组检出率高6.39%，而两组的OD 值无显著差异（P＞0.05）。A 组灵敏度（真阳性率）=25/（25+8）×100%=75.76%，特异性（真阴性率）=59/（59+2）×100%=96.72%；B 组灵敏度=25/（25+2）=92.59%，特异性=59/（59+8）=88.06%。

表1 不同处理方法的ALV 检测结果符合情况对比

表2 不同处理方法的ALV 检出率对比

2.3 净化效果

对A 和B 品种鸡群采用优化后的细胞分毒方法，在第一世代3 次血浆分毒后，第二世代血浆ALV 检出率比第一世代首次检出率分别下降了86.40%和87.85%。第二世代胎粪ALV 检出率平均为1.06%，蛋清检出率平均为0.31%，基本实现了ALV 在鸡群中的净化（表3）。

表3 不同品种净化效果（ALV 检出率） %

3 讨论

3.1 血浆样本处理

从鸡血浆中分离血清检测ALV 是目前最常用的检测方法之一[3]。采集后的抗凝血需要处理后才能接种DF-1 细胞。抗凝血的处理方法多种多样，其中离心法是常用的方法。依据血浆中不同成分的密度，通过离心快速实现抗凝血不同成分的分层，大致分为上层血清、下层红细胞层，中间白细胞层。少量样本时，离心法是快速方便的分离血浆方法。鉴于ALV净化过程中需要处理大量的抗凝血样本，使用离心方法耗费大量人力和时间，因此本试验通过抗凝血静置的方法实现抗凝血不同成分的分层。

3.2 细胞培养状态

DF-1 细胞由于能够区分内源性和外源性的ALV，是其净化的常用细胞系[6]。DF-1 细胞培养状态、样本类型都会影响ALV 在细胞内的增殖，从而影响检测结果的准确性。本试验发现，在维持培养时，改进法培养液中含有鸡血浆，使DF-1 细胞的状态和维持时间均好于常规培养。这可能是由于血浆中含有白细胞和血小板等营养物质，会有助于DF-1 细胞的生长和维持。梁巩等[7]发现培养细胞时加入同一种动物的血清成分有利于细胞培养，其中驴血清比胎牛血清更有利。

3.3 ALV 检出率

本试验发现A 组检出率高于B 组6.39%。ALV 净化过程中，血浆中病毒检出情况直接影响净化效果。不同处理方法会直接影响检出率。改进法提高检出率的原因：其一，培养液中含有鸡血浆可使DF-1 细胞生长状态和维持时间比常规培养方法优秀，利于病毒增殖；其二，改进处理收获的血浆中含有的白细胞更丰富，病毒含量更多，利于病毒感染。本试验为提高ALV 的检出率提供了一种新思路。

3.4 品种净化

ALV 净化是一个长期的过程，一般需要4～5个世代的检测才能达到净化水平（检出率小于0.2%）[8]。ALV 净化方案多样，通过1 日龄胎粪、初期或留种前种蛋蛋清、父系公鸡血浆和精液病毒分离等方法均可实现净化[9]。样本不同检测ALV的方法也多种多样，如PCR 方法更适合组织样本病料进行临床可疑样本诊断；免疫荧光试验（IFA）则在实验室应用较多；细胞分毒检测主要应用于大量样本鉴别检测，如鸡群ALV 净化等[10]。

ALV 的细胞分毒过程对于净化效果有重要意义。本试验采用改进法进行ALV 检测和净化，2个世代后的蛋清ALV 检测阳性率平均为0.31%，证明检测净化方案效果显著，可基本实现ALV净化。

4 结论

在检测ALV 过程中，改进后的血浆样本处理方法和病毒分离过程，能够提高样本的ALV 检测效率，从而加快净化进程。