禽白血病净化检测中不同样品应用的比较

李凯航，刘 健，杨显超，赵 鹏，卫龙兴，李 鑫，杨德全，陶田谷晟，周锦萍

（1.上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103；2.山东农业大学，山东泰安 271018；3.奉贤区动物疫病预防控制中心，上海 201400）

近年来，随着对禽白血病（avian leukemia，AL）防控净化的日益重视，针对禽白血病病毒（avian leukemia virus，ALV）检测方法的相关报道[1-2]较多。目前，国际上ALV 净化检测的普遍方法是使用胎粪和蛋清作为主要检测样品，开展ALV p27抗原ELISA 检测。该方法准确、可靠，应用广泛，但存在一定技术难度。因此，个别种鸡场使用泄殖腔棉拭子作为主要净化检测样品。近年流行病学研究[3-5]发现，我国很多地方品种鸡泄殖腔棉拭子AIV p27 抗原ELISA 检测阳性率可达6%～90%，但受检鸡只不表现任何临床病变。另外，在种鸡场ALV 净化检测中，血浆病毒分离作为净化检测的主要方法之一，数据准确且可靠性高，而精液和蛋清的ALV 检出率与血浆存在一定差异。针对净化实施中这些实际问题，笔者所在实验室开展了种鸡群ALV 净化检测中多种样品的比对，以期通过比较，为ALV 净化检测中的样品选用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器及试验动物

ALV p27 抗原ELISA 检测试剂盒（货号99-09257），购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；DMEM 细胞培养液、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液（0.25%）、青链霉素溶液（100×），购自GIBCO 公司；两性霉素B，购自北京索莱宝科技有限公司；肝素钠抗凝管，购自和瑞医疗器械有限公司；其他试剂均为国产分析纯。TECAN SUNRISE 酶标仪，为瑞士TECAN 公司产品；CO2细胞培养箱，为美国Thermo 公司产品；DF-1 细胞，由山东农业大学动物科技学院禽病研究室赠送；试验用公鸡、母鸡，均来自上海某原种鸡场AL 净化第一世代的核心育种群种鸡（5 500 套），蛋清和胎粪样品由母鸡所产种蛋和雏鸡中采集。

1.2 样品种类和数量

1.2.1 泄殖腔棉拭子与其他样品比对 一是泄殖腔棉拭子与血浆：在核心群内随机挑选200 羽公鸡，同步采集公鸡泄殖腔棉拭子和血浆各200 份；二是泄殖腔棉拭子与精液：在对挑选出的200 羽公鸡采集泄殖腔棉拭子时，再随机选取其中30 羽公鸡采集精液30 份；三是泄殖腔棉拭子与蛋清：在核心群内随机挑选30 羽母鸡，同步采集母鸡泄殖腔棉拭子和所产蛋蛋清各30 份。

1.2.2 血浆与其他样品比对 一是血浆与精液：在核心群内随机挑选200 羽公鸡（与1.2.1 所选公鸡无交叉），同步采集公鸡血浆和精液各200 份；二是血浆与蛋清：在核心群中挑选蛋清ALV p27抗原ELISA 检测阳性的母鸡62 只采集血浆。

1.2.3 蛋清与胎粪比对 从育种群中随机采集30枚鸡蛋的蛋清和对应的1日龄同胞雏鸡胎粪60份，即鸡蛋和2 只雏鸡均来自于同一只母鸡。

1.3 样品采集方法

1.3.1 泄殖腔棉拭子 以1.5 mL 离心管取1.0 mL PBS 缓冲液（pH7.2），用棉签在鸡只泄殖腔内左转3 圈，右转3 圈，刮取泄殖腔内侧3～4 cm 处黏液，注意不要刮出血。刮取后，将棉签头折断放于离心管中静置过夜，浸出液上清可直接进行p27 抗原ELISA 检测。

1.3.2 血浆 母鸡开产后，每只取初产蛋1 枚，收集外壳完整鸡蛋进行编号。母鸡全血按照蛋号进行采集，公鸡全血与精液一一对应采集。用肝素钠抗凝管静脉采集1.0 mL 血液，颠倒混匀3 次，2 000 r/min 离心2 min 后吸取血浆用于病毒分离。

1.3.3 蛋清 将鸡蛋气室向上放置，用酒精棉消毒后在气室一侧打孔，用吸管或适当工具吸取蛋清，注意手不要碰到吸管头部，不要吸到卵黄。每枚鸡蛋吸取3 管蛋清，每管吸取1.0 mL 左右，置于1.5 mL 离心管内，冻存2 管以备复检，待检蛋清样品可直接进行p27 抗原ELISA 检测。

1.3.4 精液 无菌采集公鸡精液50 μL 以上，取40 μL 加至160 μL 精液稀释液中，振荡混匀，3 000 r/min 离心2 min 后收集上清用于病毒分离。

1.3.5 胎粪 每只种鸡的种蛋置于同一出壳纸袋中，待雏鸡出壳后，用1.5 mL 离心管取0.5 mL PBS 稀释液，用手将1 日龄雏鸡腹部轻轻挤压，然后在肛门处沾取粪便置于稀释液中，将棉签头于离心管中折断，用振荡器对离心管进行10 s短暂振荡，置于液氮冻存。在对一只母鸡的所有雏鸡采集完胎粪后，必须更换手套或洗手消毒以避免交叉污染。检测前取出冻存的胎粪样品融化并静置3 min，取上清直接进行p27 抗原ELISA 检测。

1.4 病毒分离培养

血浆和精液样品需先进行病毒分离培养，再使用细胞培养上清开展AIV p27 抗原ELISA 检测。吸取100.0 μL 血浆或精液样品加至已长成单层DF-1细胞的24 孔板中，将24 孔板置于37 ℃培养箱中吸附2～4 h；倾去上清，每孔加入0.5 mL PBS，清洗后弃去清洗液，加入含1% FBS 的DMEM 维持液，在37 ℃ 5% CO2条件下继续培养7～9 d；取100.0 μL 细胞培养上清，-20 ℃冻存后室温融化，反复冻融3 次后进行p27 抗原ELISA 检测。

1.5 AIV p27 抗原ELISA 检测

血浆和精液在病毒分离培养后，取细胞培养上清进行p27 抗原ELISA 检测；泄殖腔棉拭子、蛋清和胎粪可按照1.3 方法处理后直接进行 p27 抗原ELISA 检测。具体为：取出96 孔抗体包被板，加样前记录样品位置，阴、阳性对照样品（均来自ELISA 检测试剂盒，且阳性对照样品已经标准化处理，抗原水平标定为10 ng/mL）每孔100.0 μL各加2 孔；在剩余孔中加入100.0 μL 被检样品，18～26 ℃孵育60 min；用去离子水洗涤板孔，重复3 次，每孔加入100.0 μL 酶标抗体，18～26 ℃孵育60 min；洗板3 次后，每孔加入100.0 μL TMB底物，18～26 ℃孵育15 min；每孔加入100.0 μL终止液，测量并记录待测样品和对照孔在650 nm波长的吸光值A（OD650）。被检样品p27 抗原含量通过计算样品与阳性对照吸光值比值（S/P）来确定，S/P≤0.2 为阴性，S/P＞0.2 为阳性。

1.6 统计分析

被检样品p27 抗原含量通过ELISA 检测S/P值来表示，运用SPSSAU 数据分析软件对各类样品的S/P值进行配对t 检验分析。

2 结果与分析

2.1 泄殖腔棉拭子与其他样品比对

2.1.1 泄殖腔棉拭子与血浆样品 由表1可看出，虽然泄殖腔棉拭子检测为ALV p27 抗原阴性的样品，血浆检测也均为阴性，但是泄殖腔棉拭子阳性率（72.00%）大大高于相应血浆病毒分离培养后的检测阳性率（6.00%）。

表1 泄殖腔棉拭子与血浆p27 抗原ELISA 检测结果比对

2.1.2 泄殖腔棉拭子与精液样品 由表2 可见，泄殖腔棉拭子检测为ALV p27 抗原阴性的样品，精液检测也均为阴性。泄殖腔棉拭子阳性率仍然过高（80.00%），相对应的精液检测阳性率为16.67%。

表2 泄殖腔棉拭子与精液p27 抗原ELISA 检测结果比对

2.1.3 泄殖腔棉拭子与蛋清样品 由表3 可见，泄殖腔棉拭子检测为ALV p27 抗原阴性的样品，蛋清检测也均为阴性，且泄殖腔棉拭子阳性率（66.67%）仍远高于对应母鸡所产蛋的蛋清阳性率（6.67%）。

表3 泄殖腔棉拭子与蛋清p27 抗原ELISA 检测结果比对

2.2 血浆与其他样品比对

2.2.1 血浆与蛋清样品 挑选蛋清p27 抗原ELISA 检测为阳性的母鸡62 只，即蛋清阳性率为100%，然后采集对应母鸡血浆，病毒分离后检测p27 抗原，发现阳性率仅为29.03%（表4）。

表4 血浆与蛋清p27 抗原ELISA 检测结果比对

2.2.2 血浆与精液 由表5 可见，血浆p27 抗原ELISA 检测阳性率为9.00%，精液阳性率为3.50%，精液、血浆双阳性的样品仅有2 份，即同一只公鸡的血浆和精液也存在不同检测结果。

表5 血浆与精液p27 抗原ELISA 检测结果比对

2.3 蛋清与胎粪比对

蛋清检测阳性样品对应母鸡所产的2 只同胞雏鸡的胎粪中，有1 份胎粪阳性便记为相同阳性。蛋清的p27 抗原阳性率为20.0%，略低于同胞雏鸡的胎粪阳性率（26.7%），8 份胎粪阳性中有6 份与同胞蛋清为相同阳性，阳性符合率75%，详见表6。从结果可以看出，不仅蛋清和胎粪的阳性率接近，两者间的阳性符合率也高，说明蛋清样品和同胞雏鸡胎粪间检测结果的相关性强。

表6 蛋清与胎粪（同胞雏鸡）p27 抗原ELISA 检测结果比对 单位：份

2.4 检测结果显著性分析

被检样品中的p27 抗原含量可通过ELISA检测S/P值来表示，对各类样品ELISA 检测S/P值进行显著性检验（配对t 检验），发现泄殖腔棉拭子与其他样品间差异均为极显著（P＜0.01），血浆与蛋清、胎粪样品间差异均为极显著（P＜0.01），蛋清与胎粪样品间差异显著（P＜0.05），说明样品间很难相互替代，详见表7。

表7 不同样品间p27 抗原ELISA 检测结果显著性检验结果

3 讨论

泄殖腔棉拭子ALV p27 抗原ELISA 检测具有便于收集，简单易操作等优点，但据相关报道[6]，相对于血浆病毒分离法，不同类型鸡泄殖腔棉拭子ALV p27 抗原检测法存在很高的假阳性率和漏检率。针对此问题，本研究对泄殖腔棉拭子与血浆、精液、蛋清等不同样品的检测结果分别作了对应比较，结果发现，泄殖腔棉拭子p27 抗原ELISA 检测为阴性的鸡只，其他样品检测也均为阴性，但是泄殖腔棉拭子样品的阳性率远远高于其他样品，且鸡只不表现明显临床症状，这与文献[6]结果一致。推测原因应为，泄殖腔中的非特异性成分影响了检测准确性，造成该类样品检测的“假阳性率”高。因此，仅依靠泄殖腔棉拭子检测实施净化会造成鸡群淘汰率过高，既不科学也不经济，即不建议以泄殖腔棉拭子作为主要检测样品。

AL 净化监测中，始终困扰人们的是一般检测手段无法区别内源性ALV（指可整合进染色体基因组的ALV，一般为可通过染色体垂直传播的E亚型，通常致病性很弱），当前能解决这一问题的方法是使用DF-1 细胞系对ALV 进行分离培养。该细胞系对内源性ALV 有抗性，仅可有效培养出外源性病毒（指不会通过染色体传递的ALV，包括A、B、C、D 和J 亚型，致病性强，鸡群中以A、B 和J 亚型常见，净化ALV 以外源性病毒为主）。用血浆样品或组织研磨过滤样品接种DF-1 细胞，培养9 d 后，使用商品化ELISA 试剂盒检测细胞培养上清中p27 特异性抗原[7]，这种联合检测方法科学、可靠，可作为方法比较的评判基准之一。

感染禽可通过精液排出ALV，因此在净化第一世代群体内呈现一定阳性。同样地，母鸡会通过输卵管不定期排毒造成蛋清阳性，蛋清样品检测同样是净化AL 的经典方法。有研究[8]显示，种鸡群种蛋p27 抗原检出率与种鸡群及其孵化后鸡群ALV 感染情况具有较好的相关性和吻合性。在本研究中，对血浆病毒分离阳性母鸡所产蛋进行检测，发现其蛋清p27 检测阳性率为29.03%；将血浆与公鸡相应精液进行同步病毒分离，结果血浆样品检测阳性率（9.00%）略高于精液（3.50%）。这说明出现病毒血症的感染母鸡或公鸡，其生殖系统并非长期排毒，存在随机排毒现象。同样从表4～5 可见，蛋清、精液为阳性的样品，其血浆检测未必为阳性，说明病毒血症和生殖系统排毒并非同步。总之，血浆样品检测虽然科学、可靠，但因ALV 排毒特性，无法替代蛋清、精液样品检测，仅依赖血浆检测这一种方法会造成漏检现象。此外，因1 日龄雏鸡血浆采集量不能满足检测要求，所以血浆未与胎粪样品做比对。

本次比对中，雏鸡胎粪p27 抗原ELISA 检测阳性率（26.7%）略高于蛋清（20.0%），但胎粪和蛋清的阳性符合率较高。早期感染雏鸡终生带毒，如不尽早淘汰，对于鸡群净化状态的负面影响巨大。雏鸡孵化时，内源性ALV 表达较少，故胎粪检测对于鸡群净化状态评估具有重要意义。胎粪检测阳性率略高，可能与胎粪样品中含有的非特异性成分较多有关。

在ALV 净化检测中，血浆、精液、胎粪、蛋清等不同样品各有其应用局限性：血浆样品需要采集自病毒血症期间，精液和蛋清样品检测依赖于生殖系统随机排毒，胎粪样品对时效性要求严格，须在雏鸡出生24 h 内采集。而且，因血浆和精液样品病毒含量不足，需要经过病毒分离培养后检测，这对大批量细胞培养技术要求较高。在实际应用中，为了提高单世代感染动物的检出率，建议在实施净化的第一世代鸡群中，采取全群采集公鸡血浆、精液和母鸡血浆的检测方法，联合采集初产蛋蛋清、雏鸡胎粪等样品，对鸡群的出壳、育雏、开产、留种等生产阶段关键时间点进行检测，净化3～4 个世代后，再采用按比例抽查的维持净化检测方案，从而达到科学、经济、高效的整体净化效果。