一步法构建塞内卡病毒感染性克隆平台

高春柳，赵胜杰，周晓翠，魏 荣，尼 博

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.青岛嘉智生物技术有限公司，山东青岛 266000；3.黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163319；4.河南动物疫病预防控制中心，河南郑州 450000；5.中国兽医药品监察所，北京 100081）

A型塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）属于RNA 病毒科（Picornaviridae）塞内卡病毒属（Senecavirus）成员，目前仅有一个型[1]，与心病毒属（Cardioviruses）成员亲缘关系较近[2]。SVA感染可引起猪口鼻部及冠状带出现水泡样病变，同时可伴随跛行、厌食、嗜睡、皮肤充血、发热等症状，与口蹄疫（FMD）、猪水泡病（SVD）、水泡性口炎（VS）等疫病难以区分[3-4]。SVA 为单股正链RNA 病毒[5]，其基因组全长约7.3 kb，包含由666 个核苷酸组成的5'端非编码区（UTR）。非编码区后是1 个单一的长开放阅读框，编码2 181 个氨基酸组成的多聚蛋白，可被切割成12 个多肽，包括先导蛋白（L）、4 个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7 个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。SVA 3'端非编码区有71 个核苷酸，后面连有poly（A）尾巴[6]。

反向遗传技术已经广泛应用于各类RNA 病毒研究。该技术可实现在分子水平上对病毒定向改造，为RNA 病毒基因功能及致病机理研究、新型疫苗研制等提供了有效方法[7-10]。RNA 病毒的主要反向遗传学方法是，基于质粒系统递送病毒全长cDNA，细胞内cDNA 能在RNA 聚合酶启动子的作用下被转录成为病毒RNA，这些RNA 随后被翻译成多肽并被加工为成熟的病毒结构与非结构蛋白，与病毒RNA 一起包装成具有感染性的病毒粒子。据报道[11-13]，已有的SVA 反向遗传平台构建主要基于酶切连接方法，这种方法是通过RT-PCR在体外扩增病毒基因片段，利用限制性内切酶，特异性地将片段逐个构建到质粒载体上，这种方法需要进行酶切、连接、单克隆鉴定、测序等复杂程序，出错率高，耗时较长。本研究拟利用同源重组法一次性将SVA 全基因组片段、CMV 启动子、poly（A）尾巴及丁肝核酶序列（HDVr）等元件整合进低拷贝载体pWSK-29 中，构建SVA 全长感染性克隆（pWSK-29-SVA），并拯救出与亲本毒株生物学功能一致的重组病毒（rSVA），以期缩短反向遗传平台构建时间，为进一步研究SVA 致病机理、研制新型疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细胞、载体 SVA-GXT91 毒株，由本实验室分离、保存；BHK-21 细胞、pWSK-29 质粒、EGFP N2 质粒，为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 病毒RNA/DNA 核酸自动提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；反转录酶、高保真DNA 聚合酶、同源重组酶、DH5α 感受态细胞，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自Qiagen 公司；质粒抽提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；DMEM 培养基、Lipofectamine 3000，购自Invitrogen 公司；胎牛血清，购自金源康生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 构建方案如下：以EGFP N2 质粒为模板，设计含有同源臂的CMV 启动子引物，以SVA-GXT91 RNA 为模板设计含同源臂SVA 基因全长引物（表1）。含同源臂的poly（A）尾巴+HDVr，由引物自结合扩增形成。

表1 构建SVA 感染性克隆的引物序列

1.2.2 感染性克隆构建 以pWSK-29 为载体，采用同源重组技术构建pWSK-29-SVA 感染性克隆。以SVA-GXT91 RNA 为模板，扩增SVA 病毒基因片段；以引物为模板，自结合扩增poly（A）+HDVr；以EGFP N2 质粒为模板，扩增CMV 启动子。将pWSK-29 载体酶切线性化，与SVA 全基因组、CMV 启动子及poly（A）+HDVr 按比例混合，在同源重组酶ExnaseMulitS 催化下，37 ℃反应30 min 即可完成同源重组结合，实现体外环化。100 μL 感受态细胞置于冰上融化后，加入10 μL构建好的SVA 感染性克隆质粒，轻摇混匀，冰上静置30 min；随即在42 ℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上2 min，然后置于800 μL 无抗生素的LB培养液中37 ℃摇床震荡（180 r/min）45 min；以4 000 r/min 离心5 min，弃去部分上清，将剩余100 μL 液体吹吸混匀，涂布在氨苄抗性LB 培养板上；将培养板倒置在37 ℃恒温箱中培养过夜，并于次日菌落长出后进行菌落PCR 鉴定。

1.2.3 菌落PCR 鉴定 以菌落为模板，采用2×Phanta® Max Master Mix（Dye Plus）酶进行菌落PCR 鉴定。反应体系为：灭菌蒸馏水8.5 mL，2×Phanta®Max 12.5 mL，菌液模板2.0 mL，上下游引物各1.0 mL，共25.0 mL。反应条件为：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30 个循环。

1.2.4 病毒拯救 在转染前1 d，将铺满单层90%以上的BHK-21 细胞铺于6 孔细胞培养板中，将菌落PCR 鉴定正确的SVA 重组质粒通过脂质体Lipofectamine 3000 按照试剂盒建议的试验方案进行转染，同时转染EGFP N2 质粒观察转染效率，置于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养，48 h 后观察转染效率；成功转染的细胞反复冻融3 次，8 000 r/min 离心5 min 收获上清，将上清重新接种于新的BHK-21 细胞，盲传3 代（F3），观察细胞病变情况，收集发生病变的细胞毒。

1.2.5 拯救病毒鉴定 将拯救的病毒传至第5 代（F5），收获病毒培养液，通过天隆DNA/RNA磁珠法全自动核酸提取试剂盒，采用HiScript® III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）进行反转录，同时清除DNA 以排除转染质粒对测序结果的干扰。依据2017年广东SVA 全基因序列（登录号：MG428683.1），设计7 对引物（表2），能够扩增出部分重叠、覆盖SVA 全基因组序列的7条片段。以cDNA 为模板，进行PCR 扩增。反应体系为：灭菌蒸馏水19 mL，2×Phanta®Max 25 mL，cDNA 模板2 mL，上下游引物各2 mL，共50 mL。反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30 个循环。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳阳性条带切胶后送生工生物技术公司测序。

表2 拯救病毒鉴定用引物序列

1.2.6 生长曲线分析 将传至第5 代的拯救毒株与亲本毒株（MOI=0.1）分别接种铺满单层BHK-21 细胞的6 孔板中，每种毒株3 次重复，吸附1 h，PBS 洗涤2 次，加入含2%胎牛血清的培养液继续培养。在接种后6、12、18、24 h 分别收获病毒，测定不同时间点病毒TCID50，绘制病毒生长曲线，比较拯救毒株与亲本毒株的增殖特性。

1.2.7 间接免疫荧光试验 在12 孔板中接种BHK-21 细胞，待细胞生长至90%，分别接种rSVA 与亲本毒株（MOI=0.1），同时设置阴性对照；接毒18 h 后，以4%冰冷多聚甲醛固定细胞10 min；PBS 洗涤3 次后用5% BSA 溶液封闭，孵育特异性SVA 一抗（针对VP2蛋白），PBS 洗涤后孵育FITC标记的二抗，在荧光显微镜下观察结果。

1.2.8 噬斑形成试验 将拯救毒株与亲本毒株样品连续10 倍稀释后分别接种BHK-21 细胞，放置于37 ℃ 5% CO2培养箱中感染1 h；弃去病毒液，用PBS 洗涤细胞2～3 次；将低熔点琼脂糖与2×DMEM（体积比为1:1）混合后以2 mL/孔加入6 孔板中，继续培养2～3 d；在显微镜下观察，当产生明显噬斑后用4%甲醛溶液固定细胞3 h，每孔加入0.5 mL 1%结晶紫室温染色0.5 h；水洗去染色液，进行噬斑形态观察。

2 结果

2.1 SVA 感染性克隆构建策略

SVA 基因组全长较短，仅7.3 kb，可采用高保真酶一步法扩增。同时几个基因元件扩增引物设计好同源臂，使pWSK-29 载体5'端到3'端依次重组进CMV、SVA 全基因组、poly（A）+HDVr（图1）。

图1 pWSK-29-SVA 感染性克隆示意图

2.2 SVA 全基因组及相关基因片段PCR 扩增

如图2 所示：以SVA-GXT91 RNA 为模板扩增出长度约为7.3 kb 的SVA 病毒基因片段；以引物为模板，通过退火自结合方式扩增出了poly（A）+HDVr；以EGFP N2 质粒为模板，扩增出了CMV启动子。

图2 SVA 全基因组与poly（A）+HDVr、CMV片段PCR 扩增结果

2.3 同源重组及菌落PCR 鉴定

将pWSK-29 质粒经SacI/HindIII 双酶切线性化，在同源重组酶ExnaseMulitS 催化下，将CMV启动子、SVA 全基因组、polyA+HDVr 依次重组进pWSK-29 载体，构建出pWSK-29-SVA 重组质粒。将重组质粒pWSK-29-SVA 转化至感受态细胞，过夜培养后，利用鉴定引物对菌落进行PCR 鉴定并测序。经鉴定，所构建的SVA 感染性克隆质粒完全符合预期设计（图3）。

图3 pWSK-29-SVA 菌落PCR 鉴定结果

2.4 病毒拯救

收获转染后的病毒接种至新的BHK-21 细胞，48 h 后反复冻融细胞，收获F1 代病毒。将F1 代病毒连续盲传至F3 代，在显微镜下观察细胞状态。结果（图4）显示，出现典型的CPE，细胞收缩变圆，有的开始脱落，而对照细胞无变化。将拯救病毒命名为rSVA。

图4 病毒拯救显微镜观察结果

2.5 拯救病毒鉴定

F5 代rSVA 分节段PCR 扩增结果（图5）显示，成功扩增出预期大小的SVA 全基因组序列的7 个片段。经测序鉴定，测序结果与亲本毒株高度同源。

图5 拯救病毒分节段PCR 鉴定结果

2.6 生长曲线分析

为比较拯救病毒与亲本病毒的复制能力与增殖特性，绘制病毒生长曲线（图6），发现两种病毒的复制能力与增殖特性相似，无明显差异。

图6 rSVA 与亲本病毒生长曲线

2.7 间接免疫荧光试验

对亲本病毒与拯救病毒进行间接免疫荧光试验。结果（图7）显示：感染BHK-21 细胞18 h 后，亲本病毒与拯救病毒在荧光显微镜下均能显示出特异性的绿色荧光，而对照细胞没有绿色荧光产生。

图7 间接免疫荧光试验结果

2.8 噬斑形成试验

接种至BHK-21 细胞后，rSVA 与亲本病毒均能产生明显的噬斑（图8），且噬斑大小及形态基本一致，表明拯救病毒与亲本病毒具有相似的噬斑形成能力。

图8 噬斑试验结果

3 讨论

SVA 最初从被污染的PER.C6 细胞系中分离得到。污染物被认为源自胎牛血清或猪胰蛋白酶，早期作为溶瘤病毒而受到关注[14]。2015年SVA 在广东省某猪场首次被发现并报道[15]，随后逐渐蔓延至我国多个省份。SVA 可引起与FMD 等水泡病类似的临床症状并造成巨大经济损失。据报道[16-17]，近年来SVA 在我国流行分布较广泛，其诊断目前主要依赖于病原学及血清学检测，在防控方面尚未开发出商业化疫苗。

反向遗传操作技术在反转录病毒的分子特性研究中是一项重要工具[15]，为RNA 病毒在遗传特性、疫苗构建等方面奠定了重要基础。为快速构建SVA 感染性克隆平台，本试验采用快速一步法，即将SVA 全长基因组序列一次扩增，并与设计的CMV 启动子、poly（A）+HDVr 基因相连接，同时基因上的同源臂保证3 段基因能够依次插入线性化的低拷贝质粒中。在同源重组酶催化下，37 ℃反应30 min 即可一步完成同源重组结合，实现体外环化，将构建好的重组质粒pWSK-29-SVA 直接转化感受态细胞，经菌落PCR 鉴定，质粒构建正确。

重组质粒转染BHK-21 细胞后，第1 代病变不明显，在盲传3 代后可出现明显CPE，表现为细胞圆缩、脱落，初步表明病毒拯救成功。本研究在盲传至第5 代时进行病毒拯救鉴定，此时能够降低感染性克隆质粒干扰[18]，同时使用含有去除DNA 的反转录试剂盒可以清除残存质粒。通过RT-PCR 方法分7 段扩增病毒基因，并分别对扩增子进行正反两向测序，发现测序结果与亲本毒株一致。为研究拯救毒株与亲本毒株生物学特性的差异，本试验比较了F5 rSVA 与亲本第5 代SVA 的生长动力曲线，结果表明拯救毒株与亲本毒株生长动力曲线基本一致。噬斑形成试验显示，拯救毒株与亲本毒株产生噬斑大小、形状基本一致，表明一步法构建SVA 感染性克隆平台准确有效。

病毒感染性克隆的关键在于全长cDNA构建，SVA 基因组长度较短（约7.3 kb），为单股正链RNA。本研究在构建感染性克隆过程中使用高保真DNA 聚合酶，这样能够高效扩增基因组，并且可有效避免出现突变。但当片段长度大于5 kb 时聚合酶的错误率呈指数级上升，因此对于较长的基因组，若担心长片段扩增导致保真度降低，可将病毒基因组分成多节段进行扩增，同时设计好同源臂并确保连接正确，这样也可实现快速质粒构建。