血清4型和5型副猪嗜血杆菌易感仔猪发病模型的建立

宋晓明，董绍明，李佃场，宋 杰，王 森，张洪亮，秦晓冰，单 虎

（1.青岛农业大学动物医学院，山东省新兽药创制协同创新中心，山东青岛 266109；2.乳山市行政审批服务局，山东乳山 264500；3.即墨区畜牧业发展服务中心，山东青岛 266200）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS），属于巴斯德菌科（Pastteurellaceae）嗜血杆菌属（Haemophilus），为革兰氏阴性菌，是仔猪上呼吸道早期定居的菌群成员之一。该菌可引起以猪的多发性浆膜炎、纤维素性胸膜炎、脑膜炎、腹膜炎、心包炎和关节炎等多器官病变为特征的副猪嗜血杆菌病，又称格拉塞尔氏病[1]。该病在各年龄段猪群中均有发生，断奶和保育仔猪比较易感，5～8 周龄仔猪的发病率为10%～15%，发病严重的养殖场死亡率可达50%以上。HPS 呈世界性分布，危害范围比较广，与其他细菌、病毒等多病原混合感染情况严重。作为猪群一种主要的继发病原，HPS 对国内外养猪业的健康发展造成了不良影响。据报道[2]，HPS 临床分离株表现出对几种抗生素的抗性。因此，接种疫苗和血清抗体（IgG 或IgA）是控制该病的有效手段[3-4]。但由于HPS 血清型多样化且不同血清型菌株毒力差异较大，导致不同血清型菌株间交叉保护作用差，疫苗接种失败的发生率很高[5-7]。为解决上述问题，有必要构建稳定、可靠的易感仔猪感染模型，从而为HPS 致病机制、诊断和免疫研究奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 HPS 菌株

HPS 血清4型SD-05、ZC-7 株，血清5型HB-08、PZ-26 株，均由本实验室分离并保存备用。

1.2 培养基以及主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），购自英国OXOID 公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），购自Sigma 公司；新生牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture，购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.3 试验动物

21～28 日龄健康易感仔猪100 头，由试验定点猪场提供，经HPS 正向间接血凝诊断试剂盒检测确认，抗体呈阴性。

1.4 毒力测定

1.4.1 分离株复苏培养 将HPS 血清4型（SD-05、ZC-7）、5型（HB-08、PZ-26）菌株分别接种在添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSA固体培养基上复苏，连续传至第3 代；无菌条件下挑取单菌落至5 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养10～12 h，作为种子液；将种子液按照2%接种量接种至100 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min扩大培养10～12 h；应用平板菌落计数法进行活菌计数，并将菌液在4 ℃条件下9 000 r/min 离心10 min，弃上清后以PBS 分别稀释成不同浓度进行毒力测定。

1.4.2 分离株毒力测定 对于每种分离株，选取20 头健康仔猪开展试验。将仔猪随机分成4 组（A—D），每组5 头。其中A—C 为试验组，D 为对照组。对试验组仔猪腹腔注射不同浓度菌株，每头2.0 mL，同时对D 组仔猪注射PBS 作为对照，观察14 d。记录试验组发病情况，根据毒力测定结果选取毒力较强的菌株用于仔猪感染试验。

1.5 仔猪感染试验

分别以1.4.2 试验中得到的血清4型、5型最适菌株最适剂量，对5 头试验仔猪进行腹腔注射，每头2.0 mL，另外5 头仔猪注射PBS 作为对照。观察感染后仔猪临床症状，记录仔猪发病及死亡情况，对死亡猪只进行剖解，观察其心、肝、脾、肺、肾等组织器官的病理变化。

1.6 HPS 分离鉴定

1.6.1 HPS 分离培养 无菌条件下分别采集感染血清4型、5型菌株死亡仔猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、心包积液、心血、关节液、腹腔积液、胸腔积液等组织病料，并接种于含0.005%NAD 和5%新生牛血清的TSA、TSB 培养基中，37 ℃培养24～48 h，挑取疑似单菌落进一步纯化培养。

1.6.2 引物设计与合成 根据GenBank 中HPS 16s rRNA基因序列（登录号：M75065）设计引物（上游：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGTA-3'）。预计扩增目的片段大小为822 bp，引物送北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.6.3 PCR 扩增 取镜检无杂菌污染的菌液1 mL，用高速离心机10 000 r/min 离心5 min，弃掉上清液；沉淀用双蒸水溶解，再将其100 ℃煮沸15 min；12 000 r/min 离心5 min，收集上清作为模板用于PCR 扩增。反应体系为25.0 μL：上、下游引物各0.8 μL，细菌DNA 模板2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，双 蒸 水16.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTaq酶0.4 μL。反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，循环30 次；终延伸72 ℃ 10 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定分析。

2 结果

2.1 毒力测定

2.1.1 血清4型菌株 由表1～2可以看出，HPS血清4型分离株SD-05和ZC-7以攻毒剂量（1.1～1.2）×109CFU注射后，在14 d 内SD-05株可使2/5 仔猪发病，ZC-7 株则不能导致仔猪发病；加大攻毒剂量至（4.4～4.8）×109CFU 时，SD-05 株可使仔猪全部发病，并导致3/5 仔猪死亡，而ZC-7 株只有3/5 仔猪发病，2/5 仔猪死亡；当剂量增加至（8.8～9.6）×109CFU 时，SD-05 株可导致4/5仔猪死亡，ZC-7株只引起3/5仔猪死亡。因此，推测血清4型SD-05 株毒力较强。为保证易感仔猪感染模型中同时有发病和死亡病例，选择SD-05株最适感染剂量为4.8×109CFU。

表1 血清4型菌株SD-05 株对健康易感断奶仔猪毒力测定结果

表2 血清4型菌株ZC-7 株对健康易感断奶仔猪毒力测定结果

2.1.2 血清5型菌株 由表3～4 可以看出，血清5型分离株HB-08 和PZ-26 以攻毒剂量（1.1～1.175）×109CFU 注射时，在14 d 内，HB-08 株可使3/5 仔猪发病，PZ-26 株可使2/5 仔猪发病；加大剂量至（4.4～4.7）×109CFU 时，HB-08 株可使全部仔猪发病，并导致4/5 仔猪死亡，PZ-26 株也可使全部仔猪发病，但只引起2/5 仔猪死亡；当进一步加大攻毒剂量至（8.8～9.4）×109CFU 时，HB-08 株可引起仔猪全部死亡，PZ-26 株只引起3/5 仔猪死亡。因此，推测血清5型HB-08 株毒力较强。同样地，为保证易感仔猪感染模型中同时有发病和死亡病例，选择HB-08 株最适感染剂量为4.7×109CFU。

表3 血清5型菌株HB-08 株对健康易感断奶仔猪毒力测定结果

2.2 感染仔猪病理变化

2.2.1 感染血清4型SD-05 株 感染后，仔猪体温升高，出现精神沉郁、呼吸困难、咳嗽、消瘦、跛行、可视黏膜发绀等临床症状。剖检可见胸腹腔内和各脏器表面有纤维素性渗出物，心脏出现“绒毛心”等病理变化（图1）。

图1 仔猪感染HPS 血清4型SD-05 株后剖检变化

表4 血清5型菌株PZ-26 株对健康易感断奶仔猪毒力测定结果

2.2.2 仔猪感染血清5型HB-08 株 仔猪感染血清5型HB-08 株后的临床表现及剖解变化（图2）与感染血清4型SD-05 株基本相同。

图2 仔猪感染HPS 血清5型HB-08 株后剖检变化

2.3 PCR 鉴定

将分离到的血清4型SD-05 株、血清5型HB-08 株经PCR 特异性扩增，得到822 bp 的目的片段（图3），与预期片段大小一致。

图3 HPS 血清4型（SD-05）、5型（HB-08）分离株PCR 产物扩增结果

3 讨论

副猪嗜血杆菌病的特征性病变是通过细菌全身性侵袭从而产生纤维性多发性浆膜炎和关节炎。HPS 能够通过粘附和侵袭上皮细胞而定居并引发感染，通过降解IgA，逃避先天免疫系统，并在宿主内部繁殖产生强烈炎症反应[8-9]。HPS 可诱导CD163+单核细胞呈比例增加，产生大量TNF-α、IL-1 和IL-6 等促炎细胞因子，并诱导上皮和内皮细胞的凋亡和白介素IL-6 和IL-8 的释放[10]，这些细胞因子在该病典型病变的炎症反应和发展中起作用。猪肺泡巨噬细胞的吞噬作用可消除HPS 非毒力菌株的感染，但其强毒株能够逃避巨噬细胞的吞噬[11]。HPS 强毒株一旦进入血液，就能以抗体非依赖性方式避免补体介导的杀伤，因此能够到达全身各部位，引起多发性浆膜炎和关节炎[12]。

不同国家或地区存在的HPS 血清型不同，菌株的毒力差异也很大。我国流行的HPS 主要血清型为4型和5型，其次是12型、13型、14型等，但个别地区间略有差异[13-18]。本试验发现，HPS不同血清型以及相同血清型的不同菌株对21～28 日龄健康易感断奶仔猪的毒力也不相同。综合试验数据，HPS 血清4型SD-05 株和血清5型HB-08 株毒力较强，对仔猪建立发病模型的最适接种剂量分别为4.8×109、4.7×109CFU。

SD-05 株和HB-08 株可导致仔猪体温升高，使其出现精神沉郁、呼吸困难、咳嗽、消瘦、跛行、可视黏膜发绀等临床症状；剖检可见，胸腹腔内以及心脏、肺脏、肾脏、脾脏等脏器表面有纤维素性渗出物，心脏出现“绒毛心”等病理变化，以上症状及病理变化为副猪嗜血杆菌病的特征性病变，且随后在攻毒死亡仔猪组织器官中成功分离到HPS 血清4型SD-05 株和血清5型HB-08 株。综上，本研究初步建立了血清4型和5型HPS 感染的仔猪发病模型，可应用于新兽用生物制品的安全性和免疫效力评价。在后续研究中，需进一步丰富完善更多指标，扩大该模型的应用范围。本研究为HPS 致病机制、诊断和免疫研究奠定了基础。