薏苡仁提取物对人皮肤原代成纤维细胞MMP1/3 mRNA表达的影响

曹晓佳，吕安琪，张理涛，单士军

（1.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古自治区 呼和浩特 010050；2.厦门大学附属翔安医院，福建 厦门 361101；3.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）

人皮肤成纤维细胞（Human dermal fibroblasts，HDF）是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，其可以产生胶原蛋白、纤维黏连蛋白、板层素、糖胺聚糖、韧粘素等细胞外基质。紫外线（UV）可能使成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常[1]，导致皮肤光老化，主要表现为皮肤粗糙、皱纹、色沉、松弛等。中波紫外线（UVB）主要引起表皮层及真皮浅层的病变。UV辐射的能量通常被细胞中的蛋白质和脱氧核糖核酸（DNA）所吸收并引起多种的DNA损伤及一系列信号传导通路活化，产生生长因子或细胞因子，改变多种不同基因的表达特异性[2]，其中基质金属蛋白酶（MMPs）在皮肤光老化的病理生理机制中起了核心作用，其可以特异性降解几乎所有的细胞外基质成分[3]，引起皮肤光老化。

薏苡仁提取物（ESC）有抗肿瘤、免疫调节、抗炎等功效[4]，有研究发现ESC还可以抑制环氧脂合酶以及核因子激活的B细胞的κ-轻链增强（NF-κB）的表达，进而抑制MMPs的表达。笔者提取了原代HDF进行体外实验，研究ESC对UVB照射后的HDF的MMPs表达的影响，探讨ESC抗光老化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织来源 人皮肤组织由厦门大学附属翔安医院获得。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、青链霉素、胰酶购自 Biological Industries（BI），胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，薏苡仁提取物由浙江康莱特公司惠赠，RNA提取试剂、逆转录试剂、RT-PCR试剂购自天根生物有限公司，MTT、胶原酶、DMSO购自Sigma公司。

1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪购自Biometra公司，低温超速离心机购自Sigma公司，紫外分光光度仪购自Beckman公司，紫外照射仪购自上海希格玛高技术公司。

1.2 方法

1.2.1 原代HDF的提取与培养 采用组织块贴壁法进行原代HDF的提取，用含10%FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。从临床获取的组织，用无菌纱布包裹，迅速转移至无菌超净台内，浸泡在含有双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）中，漂洗数次，剪去皮下脂肪，表皮面向上浸入含0.25%胰蛋白酶的培养基中。24 h后分离表皮与皮下组织，将真皮组织剪碎，置于含有胶原酶的10%FBSDMEM培养基中，5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。此后每3天换液，当细胞融合达80%时传代，第3～6代细胞用于实验。

1.2.2 ESC对原代HDF增殖能力的影响 实验采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT），分为不同浓度ESC组和对照组。将细胞以1×106/mL浓度接种于96孔板，待细胞生长融合至90%左右，弃培养基，PBS冲洗，对照组给予100μL无血清培养基，ESC 组分别给予含有 1、2.5、5、7.5、10 μL/mL 浓度的ESC无血清培养基，总体积为100 μL，孵育24 h后，加入20 μL 5 g/L的MTT，孵育4 h后弃上清，加入200 μL DMSO，室温振荡15 min，于490 nm波长处测定每组吸光度（A）值，计算各组细胞的增殖活力。

1.2.3 细胞紫外照射 实验分为3组：ESC组、基质组和模型组。各组又根据实验照射UVB剂量的不同分为10、30、60 mJ/cm2UVB组。UVB照射采用3～6代的细胞，以1×106/mL浓度接种于6孔板，待细胞生长融合至90%左右，弃培养基，PBS冲洗，300 μL PBS形成细胞表面液膜，311 nm窄波UVB光源照射，照射距离15 cm。照射结束弃PBS，模型组给予无血清DMEM，基质组给予含基质的无血清DMED，ESC 组分别给予含有 ESC1、2.5、5 μL/mL 的DMEM。孵育24 h，弃上清，0.25%胰酶处理后收集细胞。

1.2.4 总RNA提取和cDNA合成 收集细胞，根据Trizol法提取RNA。测定获取的RNA浓度和其A260/A280值。取2 μL总RNA逆转录合成cDNA，反应体系为 20 μL，反应条件为 5℃ 1h，99℃ 15 min，5℃5min，获取cDNA置于-80℃保存备用。

1.2.5 聚合酶链反应（PCR）扩增 MMP1 409 bp引物序列，上游引物5'-ATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGA-3'，下游引物5'-ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG-3'。MMP 3 194 bp引物序列，上游引物 5'－TATGGATCCCCCCCTGACTCCCCTGAG-3'，下游引物5'-ATG GAA TTC AGG TTC AAGCTT CCT GAG G-3'。内参GAPDH 313 bp引物序列，上游引物 5'-TCC，TGT，GGC，ATC，CAC，GAA，ACT-3'，下游引物 5'-GAA，GCA，TTT，GCG，GTG，GAC，GAT-3'。PCR扩增反应体系20 μL，反应条件为50℃2 min，95℃3min，95℃20s，58℃20s，72℃20s，39 个循环。

1.3 统计学方法 以SPSS 22.0对实验数据进行统计分析，正态分布计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），Bonferroni法对数据进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代HDF的培养 显微镜下观察HDF生长良好，为长梭型，细胞透明度大，均质。见图1。

图1 第4代HDF图像（×200）

2.2 ESC对原代HDF增殖的影响 MTT结果显示：不同浓度的ESC处理原代HDF后，各组吸光度值与空白对照组相比，变化不明显，差异无统计学意义（P=0.695<0.05），说明ESC对HDF基本没有毒性，见表1。

表1 ESC对HDF增殖活性的影响

2.3 不同剂量UVB照射后HDF中MMP1、MMP3 mRNA表达的变化 采用实时定量PCR法检测处理前、后细胞中MMP1、MMP3 mRNA的表达水平。

分别以UVB0mJ/cm2照射组（空白组）的MMP1、MMP3 mRNA表达量为1进行计算。结果表明4组之间总体差异有统计学意义（P=0.00<0.05），组间比较采用Bonferroni法检验，各组之间差异有统计学意义（P=0.00<0.05），见表 2。

表2 UVB照射对HDF中MMP1、MMP3 mRNA表达的影响

2.4 ESC对UVB照射后的HDF中MMP1、MMP3 mRNA表达的影响 原代HDF采用UVB 30 mJ/cm2照射后，ESC 组加入 1、2.5、5 μL/mL 的 ESC，孵育24 h；基质组加入 1、2.5、5 μL/mL 基质，孵育 24 h；收集细胞，检测MMP1、MMP3 mRNA表达的变化。

分别以空白组HDF的MMP1、MMP3 mRNA表达量为1进行计算。结果表明7组之间总体差异有统计学意义（P=0.00<0.05），组间比较采用Bonferroni法检验。3种浓度的ESC和空白组比较，差异有统计学意义（P13<0.05，P15<0.05，P17<0.05）；3 种浓度的ESC间比较，差异有统计学意义（P35<0.05，P37<0.05，P57<0.05）；相同浓度的基质和ESC组比较，差异有统计学意义（P23<0.05，P45<0.05，P67<0.05）；见表 3。

表3 ESC对30 mJ/cm2UVB照射后HDF中MMP1、MMP3 mRNA表达的影响

3 讨论

ESC是以中药薏苡仁采用临界萃取技术获得，其化学成份含薏苡仁酯，并含多种微量活性物质和必须脂肪酸，如肉豆蔻酸、芸苔甾醇、亚油酸、生育酚、多糖类、少量维生素B1、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸薏苡素、薏苡酯、薏苡内酯、α-β-谷甾醇、三萜化合物等。国外研究表明，薏苡仁可协同其他药物增强抗肿瘤活性，改善肠道微生物区缓解溃疡性结肠炎的症状等[5-6]。已有研究证明，外用对特应性皮炎模型小鼠皮损有治疗作用[7]。目前薏苡仁临床应用于风湿性和类风湿性关节炎、痛风、结肠炎、慢性腹泻、功能性消化不良、皮肤病、乳腺疾病等多种疾病[8]。

HDF是皮肤真皮层中主要细胞，对皮肤UV损伤的修复有着重要作用。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKS）是参与氧化、UV等应激条件下细胞内主要的信号转导系统之一，其中的关健分子p38及c-Jun氨基端激酶（JNK）为主要信号通路，参与了皮肤光老化的信号转导过程。JNK和p38被磷酸化后最终启动转录因子，使c-Jun和c-Fos的mRNA和蛋白高表达，激活AP-1，AP1为MMPs转录所必需，从而促使MMPs高分泌[9]。其中，MMP1可以降解Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维[10]，MMP3可以降解基底膜中的Ⅳ型胶原纤维，并部分降解其他胶原纤维[11]。UV诱导的MMPs可直接降解胶原，也可通过MMPs产生的胶原降解产物间接抑制胶原合成[12]。NF-κB是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子，正常生理条件下处于非活化状态，而UV照射可导致其活化[13]。活化的NF-κB可进入细胞核调节靶基因的表达。

对于薏苡仁的药理活性研究最为深入的是抗肿瘤作用，其能显著抑制无胸腺裸鼠的乳腺癌的生长，已检测到特异基因的表达变化，提示ESC能特异性抑制NF-κB诱导的基因转录，并且还能抑制NF-κB的一个主要信号转导介质蛋白激酶C的活性[14]。因此笔者推测，ESC可以抑制环氧脂合酶以及NF-κB的表达，进而可抑制MMPs表达。

本研究中，笔者用MTT法检测ESC对原代HDF增殖的影响，结果表明加入不同浓度ESC对的HDF的增殖能力无明显影响。笔者选取不同辐照剂量的UVB照射体外分离培养的原代HDF，采用实时荧光定量技术检测了MMP1和MMP3 mRNA表达。结果表明ESC可有效降低30 mJ/cm2UVB照射后的HDF中MMP1、MMP3基因的表达，差异有统计学意义，且有剂量-效应关系。可见ESC可以减少UVB诱导的MMPs表达，减少真皮层胶原纤维的降解，减轻UVB所致的氧化应激损伤，延缓细胞光老化的发生和进展。

近年研究表明，有些中草药基于含有许多生物活性成分，如多糖、黄酮、微量元素、维生素、激素及类激素等，通过抗氧化应激、抗炎性反应、抗细胞凋亡、升高透明质酸含量水平、调节机体免疫功能等延缓皮肤光老化[15]，如三七皂试R1、表没食子儿茶酚没食子酸酯（EGCG）、雷公藤红素、芍药苷、悬钩子等。中草药多糖成分已证实是防治光老化的重要成分，主要机制集中在增强清除自由基能力、促进皮肤成纤维细胞增殖、降低MMPs含量、促进胶原蛋白合成等方面[16]。笔者的研究中只做了MMPs基因的基础性研究，ESC抗光老化的具体分子机制尚待进一步探讨，也需更多的研究来验证。本次研究为以后的ESC抗光老化相关的分子机制及动物临床实验研究提供了基础依据，也为中草药抗光老化的临床治疗提供了新的思路。