Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立及应用

杨晶晶，金红岩

(西藏职业技术学院，西藏 拉萨 850000)

我国学者对于FAdV-Ⅰ的诊断方法己经开展了部分研究，罗洋洋等[6]、刘琳等[7]均建立了血清4型FAdV-ⅠTaqMan实时荧光定量PCR检测方法；朱余军等[8]建立了FAdV-Ⅰ液相基因芯片检测方法；袁万哲等[9]建立了血清4型FAdV-Ⅰ PCR检测方法，实现了FAdV-Ⅰ感染的临床准确诊断。荧光定量PCR方法和液相基因芯片方法的敏感性非常高，但二者需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员技术水平要求较高，不适合基层实验室使用；常规PCR方法不需要昂贵的仪器，检测成本低，对操作人员技术水平要求不高，但常规PCR方法的敏感性有限。套式PCR方法是在常规的PCR方法基础上增加1对检测引物，通过2轮PCR扩增反应，大大提高PCR扩增的敏感性，其敏感性可与荧光定量PCR方法相当，特别适合于基层兽医实验室使用，对处于潜伏期感染的病毒和早期感染的病毒具有很好的检出率，适用于疾病的早期诊断[10-11]。有研究表明，我国FAdV-Ⅰ的流行病毒株主要有血清4型、8a型、8b型、10型和11型[12-14]，因此有必要建立一种针对FAdV-Ⅰ众多流行血清型的通用检测方法。鉴于此，本研究在常规PCR方法的基础上，增加1对检测引物，通过套式PCR反应条件的优化，建立FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法，并将其应用于临床样品检测，以期为FAdV-Ⅰ的检测提供一种通用、简单、敏感的方法。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞与病料来源

血清4型FAdV-Ⅰ(病毒含量TCID50为107.0/0.1 mL)、减蛋综合征病毒病毒(EDSV)、鸡痘病毒(APV)、马立克病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DEV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和鸡肝癌细胞(LMH)均由西藏职业技术学院保存；91份临床病料样品分别于2017—2020年采集于西藏周边养殖场病死鸡、鸭临床病料。

1.2 主要试剂

2×TaqMaster Mix、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒为AXYGEN公司产品。

1.3 套式PCR引物的设计与合成

根据GenBank上FAdV-Ⅰ不同血清型Hexon基因序列，利用生物学软件Oigo6.0选择保守区域设计内、外2对特异性检测引物(引物信息详见表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒基因组DNA的提取

利用病毒基因组提取试剂盒提取病毒基因组DNA。

1.5 外引物单重PCR的扩增及检测

PCR反应体系为：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、核酸DNA(浓度为56 ng/μL)5 μL、外引物F1、R1(浓度为20 μmol/L)各0.5 μL、水6.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经核酸电泳观察结果。

1.6 内引物单重PCR的扩增及检测

PCR反应体系为：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、核酸DNA(浓度为56 ng/μL)5 μL、内引物F2、R2(浓度为20 μmol/L)各0.5 μL、水6.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经核酸电泳观察结果。

对于250 MW的发电电动机，槽电流最好控制在4 000～6 000 A左右，因此，最优的支路数为4，此时槽电流为5 091 A。

1.7 套式PCR方法的建立

1.7.1 套式PCR的预设反应条件

利用外引物对FAdV-ⅠDNA进行第一轮PCR扩增，PCR反应体系为：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、核酸DNA(浓度为56 ng/μL) 5 μL、外引物F1、R1(浓度为20 μmol/L)各0.5 μL、水6.5 μL；PCR反应程序预设为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环。取第一轮PCR扩增产物1 μL为模板，利用内引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系为：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、第一轮PCR扩增产物1 μL、内引物F1、R1(浓度为20 μmol/L)各0.5 μL、水10.5 μL；PCR反应程序预设为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环。

1.7.2 套式PCR反应条件的优化

在相同的扩增条件下，分别改变不同退火温度(52、54、56、58和60 ℃)、不同模板DNA浓度(224、112、56、28和14 ng/μL)、不同引物浓度(80、40、20、10和5 μmol/L)，确定最佳退火温度、最佳模板用量及最佳引物添加量。

1.8 特异性试验

分别提取FAdV-Ⅰ、EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV的核酸，利用优化确定的最佳PCR扩增条件进行套式PCR扩增，确定套式PCR方法的特异性。

1.9 敏感性试验

利用灭菌水将FAdV-Ⅰ(病毒含量TCID50为107.0/0.1 mL)进行10倍梯度系列稀释，分别提取各稀释度的病毒基因组DNA，按照最优确定的套式PCR反应条件分别对各稀释度的病毒基因组DNA进行扩增，确定套式PCR方法的敏感性。

1.10 重复性试验

批内重复性试验：提取3个不同浓度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)的FAdV-Ⅰ基因组DNA，按照最优套式PCR反应条件依次进行检测，每份样品平行做3个重复，确定套式PCR方法的批内重复性。

批间重复性试验：提取3个不同浓度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)的FAdV-Ⅰ基因组DNA，按照最优套式PCR反应条件于3个不同时间分别进行检测，确定套式PCR方法的批间重复性。

1.11 符合性试验

FAdV-Ⅰ的分离鉴定方法：将采集的病死鸡肝脏组织溶解于10倍体积灭菌PBS(pH=7.2)中，经研磨、反复冻融3次后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，经0.45 μm滤膜过滤除菌后接种至长成单层的LMH细胞，37 ℃ 5% CO2培养箱中培养至24～36 h，当出现明显的细胞间隙增大、细胞变圆、聚集成不规则葡萄串状等典型细胞病变时判为病毒分离鉴定结果为阳性。利用套式PCR方法和病毒分离鉴定方法分别对22份临床病料样品进行检测，比较分析2种检测方法的阳性样品数和阴性样品数，计算2种检测方法的符合率，确定套式PCR方法的准确性。

符合率=(2种检测方法检测结果相同样品数/样品总数)×100%。

1.12 临床应用

利用建立的套式PCR检测方法对2017—2020年采集的西藏部分养殖场疑似FAdV-感染的临床病死鸡、鸭病料样品91份进行检测，阳性样品PCR扩增产物全部送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定，对测序结果通过Blast进行在线比对分析，序列比对分析结果可以鉴定出阳性样品的血清型，评估套式PCR方法对检测FAdV-Ⅰ的通用性，确定套式PCR方法的临床适用性。

2 结果与分析

2.1 PCR的扩增

外引物对FAdV-Ⅰ可扩增出约592 bp的特异性条带(图1A)，内引物对FAdV-Ⅰ可扩增出约356 bp的特异性条带(图1B)，利用套式PCR预设反应条件对FAdV-Ⅰ可扩增出约356 bp的特异性条带(图1C)，条带大小均与试验预期相符。

M. DL2000 DNA Marker；1. FAdV-Ⅰ；2. 阴性对照

2.2 套式PCR反应条件的优化

在相同的反应条件下，确定套式PCR方法第一轮的最佳退火温度为56 ℃(图2)，最佳模板DNA浓度为56 ng/μL(图3)，上、下游引物最佳浓度为20 μmol/L(图4)。确定套式PCR方法第二轮的最佳退火温度为56 ℃(图5)，上、下游引物最佳浓度为20 μmol/L(图6)。

2.3 特异性试验

如图7所示，利用建立的套式PCR检测方法分别对FAdV-Ⅰ、EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV进行扩增，结果只有FAdV-Ⅰ扩增出356 bp的特异性条带，与预期相符，而EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV扩增结果均为阴性，说明套式PCR方法具有良好的特异性。

2.4 敏感性试验

如图8所示，10-1～10-6倍梯度稀释的FAdV-Ⅰ(病毒含量TCID50为107.0/0.1 mL)经外引物单重PCR、内引物单重PCR、套式PCR扩增后，外引物单重PCR和内引物单重PCR的检测下限均为104.0TCID50，套式PCR的检测下限为102.0TCID50，套式PCR方法比外引物单重PCR方法和内引物单重PCR方法的敏感性均高出100倍，说明套式PCR方法敏感性更强。

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 退火温度分别为52、54、56、58和60 ℃

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 模板浓度分别为224，112，56，28和14 ng/μL

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 引物添加量分别为80，40，20，10和5 μmol/L

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 退火温度分别为52、54、56、58和60 ℃

M. DL2000 Marker；1～5. 引物添加量分别为80，40，20，10和5 μmol/L

M. DL2000 DNA Marker；1. FAdV-Ⅰ；2. EDSV；3. APV；4. MDV；5. ILTV；6. DEV；7. AIV-H9；8. NDV；9. IBV

M. DL2000 DNA Marker；1. 106.0 TCID50；2. 105.0 TCID50；3. 104.0 TCID50；4. 103.0 TCID50；5. 102.0 TCID50；6. 101.0 TCID50

2.5 重复性试验

如图9所示，批内重复性试验中FAdV-Ⅰ3个不同浓度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)3个重复的检测结果完全一致，批间重复性试验中FAdV-Ⅰ3个不同浓度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)于3个不同时间检测的结果完全一致，表明套式PCR方法具有良好的可重复性。

M. DL2000 DNA Marker；1～3. 批内重复性试验中105.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的3个重复；4～6. 批内重复性试验中103.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的3个重复；7～9. 批内重复性试验中101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的3个重复；10～12. 批间重复性试验中105.0 TCID50、103.0 TCID50、101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的第1次检测；13～15. 批间重复性试验中105.0 TCID50、103.0 TCID50、101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的第2次检测；16～18. 批间重复性试验中105.0 TCID50、103.0 TCID50、101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的第3次检测

2.6 符合性试验

22份临床病料样品经套式PCR方法和病毒分离鉴定方法检测的结果如表2所示，套式PCR方法共检测出阳性样品14份，而病毒分离鉴定方法共分离鉴定出病毒12株，套式PCR方法相对于病毒分离鉴定方法的符合率达90.91%(20/22)。将2份病毒分离鉴定为阴性，而套式PCR方法检测为阳性的PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，测序结果表明2份阳性样品均为FAdV-4特异性核苷酸序列，说明套式PCR方法的敏感性高于病毒分离鉴定方法，套式PCR方法具有良好的准确性。

表2 符合性试验检测结果

2.7 临床应用

利用建立的套式PCR检测方法对2017—2020年采集的西藏部分养殖场疑似FAdV-Ⅰ感染的临床病死鸡、鸭病料样品91份进行检测，结果如表3所示，共检测出阳性样品58份，阳性感染率达63.74%。58份阳性样品PCR扩增产物的序列测定比对分析结果表明：临床表现为心包积液的28份阳性鸡病料样品均为血清4型；临床表现为肝脏肿大、易碎的21份阳性鸡病料样品中有5份为血清4型，8份为血清8a型，6份为血清8b型，2份为血清11型；临床表现为肌胃糜烂的6份阳性鸡病料样品中有2份为血清4型，1份为血清8b型，3份为血清11型；临床表现为肝脏肿大、易碎的3份阳性鸭病料样品均为血清4型。综合以上试验结果，我国现阶段流行的FAdV-Ⅰ主要有血清4型、8a型、8b型和11型。

表3 临床样品检测结果

3 讨论

FAdV-Ⅰ近几年呈逐渐流行趋势，由于FAdV-Ⅰ血清学型众多，不同血清型引起的临床症状差异较大，尤其是引起的包涵体肝炎、肌胃糜烂等临床症状与禽白血病、戊型肝炎等疫病感染极其相似，临床中通过临床症状和病理剖检很难进行FAdV-Ⅰ感染的确诊，鉴别诊断需要借助实验室检测方法进行，目前FAdV-Ⅰ实验室检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫学和分子生物学方法[15]。病毒分离是最可靠的检测方法，但病毒分离的周期较长，不适合临床快速诊断的需要。免疫学检测方法具有一定的滞后性，无法检测出早期感染的病毒。分子生物学检测方法能够特异性检测FAdV-Ⅰ的核酸DNA，在疫病早期快速诊断方面具有病毒分离鉴定和免疫学方法无法比拟的优越性，而套式PCR方法作为分子生物学中一种变异的PCR检测方法，其使用2对PCR引物扩增基因片段，第1对PCR引物扩增和普通PCR方法相似，而第2对引物设计在第1次PCR扩增片段的内部，其对第1次PCR扩增产物进行又一轮扩增，第2对引物的第2次扩增的优点在于，如果第1次扩增产生了错误片断，则第2次扩增能在错误片段中进行引物配对的概率很低，因而降低错误发生率，且经过2次扩增可大大提高扩增反应的灵敏度，故套式PCR相对于常规PCR方法的敏感性和特异性均大大提高。禽腺病毒结构蛋白主要包括六邻体蛋白(Hexon)、五邻体蛋白(Penton)和纤维蛋白(Fiber)，其中Hexon蛋白含有中和抗原决定簇，可以诱导极强的中和反应，且FAdV-Ⅰ的12个血清型中Hexon基因具有较高的保守性[16-17]，因此本研究将套式PCR扩增的靶基因选择在Hexon基因的保守区段上，通过对GenBank登录的FAdV-Ⅰ不同基因型的Hexon基因进行比对分析，选择12个血清型FAdV-Ⅰ Hexon基因均高度保守区域设计内、外2对特异性检测引物，通过反应条件的优化，建立了FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法，其推广应用将大大提高了基层兽医实验室的FAdV-Ⅰ病原学检测能力和技术水平。

FAdV-Ⅰ可以水平传播，病毒广泛存在于鸡的粪便、气管及鼻黏膜和肾脏中，病毒通过鸡的各种分泌物和排泄物传播，在粪便中有很高的病毒滴度，健康鸡群通过接触带毒的粪便感染，在短时间内就可以通过空气传播病毒，导致在整个鸡群发生持续扩散传播；FAdV-Ⅰ也可以垂直传播，在公鸡的精液中也存在病毒，人工授精也可以将病毒扩散，蛋鸡在产蛋高峰期受到应激和性激素的影响可以出现排毒期，导致种蛋将病毒传播给下一代[18-19]。禽腺病毒感染一般在21 d后开始排毒，在感染的鸡群中，有时可以分离到多个血清型的病毒[18-19]。鉴于FAdV-Ⅰ对鸡群的综合危害性较强，防控难度较大，加强FAdV-Ⅰ的病原学监测和提高检测方法的敏感性对本病的防控尤为重要。本研究建立的FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法能够特异性扩增FADV-Ⅰ，而检测EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV均为阴性；该方法的检测下限为102.0TCID50，其灵敏度是普通PCR方法的100倍；该方法在22份临床病料样品中，其相对于病毒分离鉴定方法的符合率达90.91%，而病毒分离鉴定为阴性的2份临床病料样品经套式PCR方法检测为阳性，分析其原因可能为病毒分离鉴定方法受到细胞培养条件、病料中病毒含量、病料存储和运输时间等外界因素的影响，其成功分离鉴定率降低，导致没有成功分离到病毒，而套式PCR方法具有较高的敏感性，检测到了2份病料中的核酸DNA；该方法在检测91份临床病料样品中共检测出血清4型、8a型、8b型和11型阳性样品分别为38份、8份、7份和5份，表现出了良好的特异性、敏感性、重复性和准确性，能够用于FAdV-Ⅰ多种血清型的临床诊断，将为FAdV-Ⅰ的临床诊断、流行病学监测、疫病防控和净化提供技术支持。