HPLC-MS/MS检测动物性食品中呋喃唑酮残留量的方法研究

◎ 陈 燕，李康柏，许均图，陈德斌，洪瑞申，王 景

（广州华鑫检测技术有限公司，广东 广州 510642）

呋喃唑酮是硝基呋喃类的一种，有良好的抑菌作用，可用于治疗因细菌和原虫引发的肠道疾病（如肠炎，痢疾，溃疡等）。呋喃唑酮经代谢后会产生呋喃唑酮代谢物，与呋喃唑酮一起经食物链积累到人体内，过量可导致头晕、恶习和腹泻等不良症状[1]。我国早在2008年就将包含呋喃唑酮在内的硝基呋喃类药物列为禁用药，不得在动物性食品中检出[2]。

针对呋喃唑酮这一禁用药物，我国制定了一系列行业标准和地方标准进行检测，检测对象主要包括饲料[3]、水产品[4]、动物性食品[5]，大都基于高效液相色谱法，但对于部分初级农产品及其加工食品不够灵敏高效，所以开发灵敏可靠的检测方法极为重要。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-三重四极杆质谱仪（安捷伦1200-6410）；漩涡振荡器；旋转蒸发仪（德国IKA RV 10 Basic V）；纯水机（Millipore Milli-Q）；分析天平（赛多利斯BSA224S-CW）；分液漏斗；抽滤装置。

二氯甲烷和甲醇为色谱纯级别，购于汉尼韦尔公司；乙酸铵和无水硫酸钠为分析纯级别，购于广州化学试剂厂。

1.2 呋喃唑酮标准溶液配制

标准品购自西格玛公司，准确称取10 mg呋喃唑酮，用50 mL甲醇超声溶解，并用甲醇定容至100 mL，配成100 μg·mL-1的标准贮备液，放置于-18 ℃的冰箱中保存。实验时，取储备液放至室温，根据需要配成适当浓度的标准工作液，现配现用。

1.3 仪器工作参数

（1）液相色谱条件。安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱分离柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.005 mol·L-1醋酸铵；流动相B：乙腈，A∶B=8∶2；流速：0.5 mL·min-1；进样体积，10.0 μL。

（2）电喷雾离子源参数设置：正模式；温度350 ℃；气流速10 L·min-1；压力345 kPa；电压4 000 V；MRM多重反应监测。母离子和子离子质荷比参数设置如表1所示。

表1 呋喃唑酮的质谱参数设置表

1.4 测定步骤

（1）提取。称取5.00 g（精确至0.01 g）样品，置于50 mL离心管中，避光，加入15 mL二氯甲烷，振摇5 min，静置分层，取下层二氯甲烷于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL二氯甲烷重复提取一次，合并二氯甲烷，将所收集到的二氯甲烷提取液经无水NaSO4柱滤入梨形瓶中，再用10 mL二氯甲烷冲洗无水NaSO4柱，并用洗耳球吹出柱中液体，滤液于旋转蒸发仪上45 ℃减压蒸发溶剂至干。

（2）净化。加入1 mL流动相至浓缩瓶，用漩涡振荡器振荡润洗2 min，经0.22 μm滤膜后供液相色谱-串联质谱测定。

（3）空白实验。除不加试样外，与试样实验同步进行。

1.5 结果计算

试样中呋喃唑酮的含量X按式（1）进行计算。

式（1）中，X-试样中呋喃唑酮的实际计算含量，μg·kg-1；CS-标准溶液中呋喃唑酮的理论浓度，ng·mL-1；A1-试样液中呋喃唑酮的实际测试峰面积；A2-空白试验的实际测试峰面积；V-试样的定容体积，mL；AS-标准中呋喃唑酮的实际测试峰面积。

2 结果与分析

2.1 质谱参数的优化

取1.0 μg·mL-1标准溶液至样品瓶中，在不经过色谱柱分离的情况下，分别于正、负离子模式下进行测试，确定呋喃唑酮的母离子为226.2，监测模式为正离子模式。通过二级质谱分析，确定在质荷比122.3处丰度最强，故选取作为定量离子，139.3作为定性离子。

2.2 提取试剂的优化

分别采用不同的提取试剂做单因子变量实验，在添加水平0.10 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1三个浓度处分别做6组平行测试。用乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、环己烷作为提取试剂时，具体的回收率如表2所示。

表2 不同提取剂的呋喃唑酮回收率统计表

从表2分析可得，乙酸乙酯、正己烷、环己烷作提取试剂时回收率较差，选用二氯甲烷作为提取剂时回收率较好，故选取二氯甲烷作为提取试剂。

2.3 标准曲线绘制

配制浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1的呋喃唑酮标准溶液，依次通过C18反相色谱柱分离、电喷雾离子化后进入三重四极杆质谱分析，以标液浓度为横坐标，对应浓度的仪器响应值为纵坐标绘制标准曲线。发现呋喃唑酮在0.5～20 ng·mL-1浓度范围内线性关系较好，变异系数为0.998 7，拟合方程为y=769.68x-111.1，标准曲线如图1所示。

图1 呋喃唑酮的拟合曲线和方程图

通过C18色谱柱分离，确定呋喃唑酮的保留时为3.2 min，子离子122.3和139.3响应灵敏，结果如图2、图3所示。

图2 呋喃唑酮总离子流图

图3 呋喃唑酮多重反应监测谱图

2.4 检测方法评价

（1）灵敏度。应用本方法检测动物性食品中呋喃唑酮，取3倍最低检测信噪比对应的加标量为方法检出限，10倍为定量限，算得检测限为0.3 μg·kg-1，定量限1.0 μg·kg-1。

（2）准确度。本方法检测食品中呋喃唑酮在0.5～20.0 ng·mL-1浓度范围内的线性关系较好。 在0.10～1.00 μg·kg-1添加水平下，呋喃唑酮的回收率为74.6%～93.0%。

（3）精密度。应用本方法检测动物性食品中呋喃唑酮,取罗非鱼鸡肉为样品，做6个平行加标样，加标含量为1.0 μg·kg-1，测得样品浓度如表3所示，计算相对标准偏差RSD6为3.85。

表3 精密度计算表

3 结论

本实验建立了HPLC-MS/MS测定动物性食品中呋喃唑酮残留量的检测方法，采用二氯甲烷作为提取剂，样品提取液经净化、浓缩后，由C18反相色谱柱分离，MRM模式定量检测。该方法具有效率高、重现性好的特点，适用于动物性食品中呋喃唑酮残留量的检测。