黑木耳中粗多糖检测前处理条件的研究

◎ 吴家玲，龚晓莹，陈晓嘉，麦慧甜

（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；3.广东省食品质量监督检验站，广东 广州 511442）

黑木耳又名黑菜，属于层菌纲木耳科，可药食两用[1]。黑木耳具有很高的营养价值，富含蛋白质及8种人体必需的氨基酸，还含有多种糖类、维生素和微量元素等营养成分[2]。黑木耳富含多种活性成分，如胶原、多糖、木耳黑色素、卵磷脂、植物碱和发酵素等[1]。其中，多糖是黑木耳的主要活性成分[3-4]，具有预防高血压、高血脂、冠心病、抗血栓及抗衰老等作用[5]，广泛应用于医药和食品中。

多糖在植物、动物与微生物体内广泛存在，是天然高分子中的一大类。目前，食品中多糖的测定方法主要是碱性酒石酸铜滴定法和比色法（苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法）两种。一般来说，比色法优点是灵敏度高（可达μg·mL-1，滴定法为mg·mL-1），样品用量少；缺点是做常规测定时用葡萄糖作为对照品，误差较大。其中，苯酚-硫酸分光法是粗多糖测定最常用的方法，其原理是多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，再与苯酚-硫酸作用生成橙红色化合物，其呈色强度与溶液中糖的浓度成正比[6]。

本文使用苯酚-硫酸法测定黑木耳中粗多糖含量，针对黑木耳中粗多糖进行检测前处理条件优化的研究，分别对样品水浴时间、乙醇浓度、离心速度、乙醇洗涤次数4个前处理条件进行单因素试验，并采取4因素4水平正交试验进行条件优化，对检测结果进行分析，得出合理稳定的检测前处理条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售黑木耳，葡萄糖（99.9%，Aladdin公司），无水乙醇、硫酸和苯酚均为分析纯（广州化学试剂厂）。

1.2 仪器与设备

ME204E/02型电子天平，METTLER TOLEDO；EX125DZH型电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；HWS-26型水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；KQ-500DE型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；3K15型离心机，北京博励行仪器有限公司；T9型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工作曲线绘制

称取0.100 0 g葡萄糖于1 L容量瓶中加水溶解并定容，即得到浓度为100 mg·L-1的葡萄糖标准溶液[6]。

分别吸取葡萄糖标准溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于25 mL比色管中，用蒸馏水补至1.0 mL。向试液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，静置10 min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将比色管放置于30 ℃水浴中反应20 min，于490 nm处测吸光度。

标准曲线及回归方程由紫外分光光度计自带软件UVWin6.1软件得出，回归方程为y=91.583 75x+1.800 6，相关系数R2=0.999 3，标准曲线如图1所示。

图1 标准曲线图

1.3.2 样品前处理

将准备好的样品置于200 mL容量瓶中，加蒸馏水100 mL左右，沸水浴回流提取1 h，冷却至室温后补水至刻度，混匀后过滤，弃去初滤液，收集剩余滤液供沉淀粗多糖。取样液5 mL加入20 mL无水乙醇，同时使用涡旋振荡器振摇，超声提取30 min[7]。提取结束后，于4 000 r·min-1条件下离心10 min，弃去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗涤、离心。用蒸馏水将上述不溶物转移至100 mL容量瓶中并摇匀，取1 mL样品溶液于25 mL比色管中，并做空白试验，样品和空白与标曲显色步骤一致，最后比色并代入回归方程进行计算[6]。

1.3.3 粗多糖的含量计算

按照式（1）计算黑木耳中粗多糖的含量：

式（1）中：X-试样中粗多糖的含量，g/100 g；C-由标准曲线算得被测液中试样中粗多糖的质量，μg；m-试 样 质 量，g；V1-试 样 定 容 体 积，mL；V2-试样提取体积，mL；V3-提取总多糖后定容体积，mL；V4-测定用试样体积，mL；0.9-葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.3.4 单因素试验

分别对水浴时间（1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h）、乙醇浓度（75%、80%、85%和90%）、离心速度（5 000 r·min-1、6 000 r·min-1、7 000 r·min-1和8 000 r·min-1）、洗涤次数（2次、3次、4和5次）4种处理条件进行单因素试验。

1.3.5 正交试验

根据单因素试验的结果，进行正交试验，以粗多糖提取率来确定黑木粗中粗多糖检测前处理最佳条件组合。

2 结果与分析

2.1 水浴时间对检测结果的影响

分别水浴1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h进行试验，分析水浴时间对检测结果的影响，结果如图2所示。从图2看出，水浴时间对粗多糖的检测结果影响明显，水浴时间延长粗多糖含量呈先递增后趋于平稳的趋势。在1.5～2.0 h粗多糖提取率增加趋势明显，2.0～3.0 h趋于平稳，3.0 h提取率达到最高。由此得出，粗多糖溶出率随水浴时间延长而提高。

图2 不同水浴时间对粗多糖检测结果的影响图

2.2 乙醇浓度对检测结果的影响

分别使用75%、80%、85%和90%的乙醇浓度进行试验，分析乙醇浓度对检测结果的影响，结果如图3所示。从图3可得出，随着乙醇浓度的提高，检测得到的粗多糖含量呈先递增后递减的规律，当乙醇浓度从75%提高至85%时检测得到的粗多糖含量逐渐增大，当乙醇浓度由85%提高至90%时检测含量出现下降。由此得出乙醇浓度85%时黑木耳粗多糖沉淀更完全。

图3 不同乙醇浓度对粗多糖检测结果的影响图

2.3 离心速度对检测结果的影响

分别使用5 000 r·min-1、6 000 r·min-1、7 000 r·min-1和8 000 r·min-1的离心速度进行试验，分析离心速度对检测结果的影响，结果如图4所示。从图4可得出，在离心速度为5 000～8 000 r·min-1时，检测得到的粗多糖含量呈先递增后趋于平稳的规律。在离心速度为5 000～6 000 r·min-1时，检测结果上升较慢；在6 000～7 000 r·min-1时，检测结果增速比较快；在离心速度为7 000～8 000 r·min-1时，检测得到的粗多糖含量呈趋于平稳的规律。由此得出，离心速度达到7000 r·min-1及以上时粗多糖沉淀较为完全。

图4 不同离心速度对粗多糖检测结果的影响图

2.4 乙醇洗涤次数对检测结果的影响

分别按照2、3、4和5次的洗涤次数进行试验，分析乙醇洗涤次数对检测结果的影响，结果如图5所示。从图5可得出，洗涤次数由2次增加到3次时，检测得到的粗多糖含量快速降低；洗涤次数为3次和4次时，检测结果差别不大；在洗涤次数达到5次时，检测结果再次出现微量下降。由此得到，乙醇洗涤次数的增加会导致黑木耳粗多糖检测含量的降低。

图5 不同乙醇洗涤次数对粗多糖检测结果的影响图

2.5 正交试验结果

根据4因素4水平正交实验L16（44）的试验结果，以“测定值与平均值相对偏差”为指标进行数据分析，获取最佳实验条件组合，结果见表1。

根据表1中4个因素的极差值R可知，对实验结果影响最大的前处理是水浴时间，次之是乙醇浓度，再之是乙醇洗涤次数，离心速度是影响最小的条件。

表1 L16（44）正交实验分析表

根据表中K1～K4与平均值的相对偏差分析得出，最佳实验条件组合为A2B2C3D3，即检测前处理条件为水浴时间2 h、乙醇浓度80%、离心速度7 000 r·min-1、乙醇洗涤次数4次。

3 结论

根据正交实验分析得出：在4个因素中，对实验结果影响最大的前处理是水浴时间，次之是乙醇浓度，再之是乙醇洗涤次数，而离心速度是影响最小的条件；其最佳实验条件组合为水浴时间2 h、乙醇浓度80%、离心速度7 000 r·min-1、乙醇洗涤次数4次。