杜马斯燃烧法测定全营养液态乳的蛋白质含量研究

◎ 梁北梅，温恺嘉，王小妹，李咏华，武林贺，许文东

（1.广州白云山汉方现代药业有限公司，广东 广州 510240；2.中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广东 广州 510240；3.广东省药用脂质重点实验室，广东 广州 510240）

蛋白质是人体必需的营养素[1-2]，也是乳制品的一个重要营养指标[3]。全营养配方液态乳是一种以牛奶为蛋白来源，同时添加多种维生素和矿物质营养素的液体营养食品[4]，根据《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》（GB 28050—2011）[5]，核心营养素的含量值为营养标签上强制标示内容。蛋白质属于核心营养素，必须在标签上体现，因此对全营养液态乳进行蛋白质含量测定非常必要。

目前食品中蛋白质测定的参考文件为《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）[6]，该标准包括凯氏定氮法、分光光度法与燃烧法。液态食品的蛋白质测定以凯氏定氮法为主[7-8]，检测过程包括了消化、蒸馏、吸收、滴定等多个环节，该法精密度高，测定结果稳定，是蛋白质测定的仲裁法，然而凯氏定氮法的缺点也很明显，检测工时长，腐蚀性试剂消耗大，对环境与实验员均有不同程度的危害，不符合绿色环保理念[9]。

杜马斯定氮仪测定蛋白质含量是以燃烧法为理论依据，以氦气或氩气为载气，样品经高温燃烧产生混合气体，最终氮氧化物全部被还原成氮气，再通过TCD检测器进行定量检测得出含氮量，进而换算为蛋白质的量[10-11]，整个分析过程仅需3～5 min，检测工作大部分由仪器自动完成，过程中不产生废液和有毒气体。燃烧法测定蛋白质的应用得到越来越多的支持，在2010年原卫生部颁布的国标文件中，燃烧法被写入标准，但其适用范围并不包括液体和蛋白质含量低于10%的样品，主要因为以往的杜马斯定氮仪检出限高、精密度低，实际应用受到限制[12]。随着科学技术的进步，新型杜马斯定氮仪检测性能提高，检出限达到微克级别，适用于食品、饲料、植物、土壤等各种低蛋白样品的测定，因此笔者选取全营养液态乳作为研究对象，对测定的氧气因子、氧气流量、样品取样量以及样品在凯氏定氮法测定结果分别进行考察，探究杜马斯燃烧法测定液体样品蛋白质的可行性。

1 材料与方法

1.1 样品与材料

全营养液态乳（批号分别为20201125、20201222-1、20201222-2、20201222-3、20201223-4、20201224-4，广州白云山汉方现代药业有限公司）；硅藻土（德国格哈特公司，批号：6830）；锡膜；包样器（德国格哈特公司）。

1.2 对照品

EDTA对照品（含氮量9.586%；批号：6974；德国格哈特公司）

1.3 仪器与设备

DT N Pro杜马斯定氮仪，德国格哈特公司；AP225WD十万分之一电子天平，日本岛津公司。

1.4 仪器条件

燃烧室温度：1 030 ℃；还原加热室温度：750 ℃；二氧化碳脱气室温度：300 ℃；检测器温度：60 ℃；氧气流量：200 mL·min-1；氧气因子：0.8 mL·mg-1。

1.5 测定

取锡膜一张，加入适量硅藻土（硅藻土与样品比例约1∶3），置于十万分之一天平中，精密加入全营养配方液态乳样品约100 mg，待硅藻土将样品液体吸附后，以包样器将样品压成饼状，置于定氮仪的自动进样器中待测，按上述1.4中的设定条件进行仪器分析，蛋白质含量按式（1）进行计算：

式（1）中：X-试样中蛋白质的含量，%；C-试样中氮的含量，%；F-蛋白质换算系数，6.25。

2 结果与分析

2.1 氧气因子的选择

氧气因子定义为每毫克样品在燃烧炉高温燃烧时仪器对样品加入氧气的量，单位为mL·mg-1。取批号为20201125的全营养液态乳样品，分别以氧气因子为0.8 mL·mg-1、1.0 mL·mg-1、1.2 mL·mg-1进行测定，测定结果见表1，样品测定图谱见图1。

表1 不同氧气因子测定蛋白质含量表（n=6）

图1 全营养液体乳蛋白质测定图谱图

当氧气因子为0.8 mL·mg-1时，其含量测定的RSD值最小，表明精密度最佳，因此选定该参数。

2.2 氧气流量的选择

氧气流量为仪器总供氧量，不同性状的样品对氧气流量的要求不同。氧气供应不足会导致样品无法充分燃烧，测定的精密度较低；氧气供应过量需消耗还原管内耗材，导致检测成本增加。取批号为20201125的全营养液态乳样品，分别以氧气流量为100 mL·min-1、200 mL·min-1、300 mL·min-1进行测定，结果见表2。

表2 不同氧气流量测定蛋白质含量表（n=6）

由 表2可 得，当 氧 气 流 量 为200 mL·min-1、300 mL·min-1时，样品测定精密度更优，结合检测成本，选定氧气流量为200 mL·min-1。

2.3 称样量的选择

杜马斯定氮仪灵敏度高[13]，称样量少，因此要求样品均匀度高。流动性强、均一性高为液体剂型的优点[14-15]，较少的取样量即可得到准确度高的检测数据。取批号为20201125的全营养液态乳样品，分别以50 mg、100 mg、150 mg为取样量，按1.4项所述条件分别进行测定，结果见表3。

表3 不同称样量测定蛋白质含量表（n=6）

由表3可知，3个取样量对测试结果标准偏差不大。笔者利用滴管进行取样，在进行50 mg取样时，滴管取样容易超出称量的限度（±10%），多次的样品称取操作造成称量误差。而样品的称样量越大，氧气量与还原管耗材损耗越多，导致检测成本增加，因此选择取样量为100 mg较合理。

2.4 准确度（加标回收率）试验

利用EDTA对照品，对全营养液体乳样品设计浓度分别为80%、100%、120%的加标回收率验证，具体结果见表4。

由表4可知，回收率在范围在99.3%～101.6%，表明准确度试验符合规定。

表4 加标回收率试验数据表

2.5 杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定结果对比

取批号为20201125的全营养液态乳样品，分别采用凯氏定氮法[6]与杜马斯燃烧法进行6次平行测定，结果见表5。

表5 杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定结果对比表

由表5可知，二者均值的比值（D/K）为0.993 5，接近1.0，绝对差值为0.03。表明凯氏定氮法与杜马斯定氮法在同种样品中呈线性相关，两种方法的测差异不显著[3,16-17]。

2.6 含量测定

取全营养液体乳5批，以1.5项所述进行蛋白质含量测定，结果见表6。

表6 全营养配方液体乳蛋白质含量测定表（n=2）

由表6可知，该法适用于本样品的测定。

3 结论

杜马斯燃烧法灵敏度高，其TCD检测器可测定mg·kg-1级别的样品，耗时少，仅需3～5 min即可完成；安全性强，不产生废液与毒气，对环境无污染。本研究以全营养液体乳为实验对象，分别对杜马斯燃烧法的氧气因子、氧气流速、称样量进行考察，探索出合适的测定条件，并对该条件进行了精密度与准确度验证，其测定结果的精密度RSD为0.90%，回收率为99.3%～101.6%，实验结果均符合规定。将其测定结果与凯氏定氮法的测定结果相比较，二者无显著差异，证实杜马斯燃烧法测定适用于测定全营养液体乳中的蛋白质。其测定结果稳定、快速、污染少，适合大量样品快速检测，杜马斯燃烧法的应用范围会越来越广。