γ-氨基丁酸A型受体相关蛋白在老年胰腺导管腺癌患者胰腺癌组织中的表达与其临床意义

王伟艺，唐文皓，张超，袁祖荣，唐健雄，姜翀弋，涂彦渊，吴兆坤

复旦大学附属华东医院普外科，上海200040

胰腺导管腺癌是最多见的胰腺恶性肿瘤，恶性程度极高，其预后极差。2019年Cancer Statistics 杂志数据显示美国胰腺癌5年生存率仅9%，转移性胰腺癌患者5年生存率3%，是美国死亡率第4 位的恶性肿瘤[1]。近年来，胰腺癌快速上升至中国恶性肿瘤死亡率第六位，其5年生存率不足8%[2]，且老年患者胰腺癌较高发，大多合并肝、肾、肺、心等脏器功能衰退，手术及化疗耐受性差，预后更差。因此，寻找老年胰腺癌术后复发转移的预测因素，是提高胰腺癌疗效迫切需要的解决方法。Klebig C 等[3]研究表明，与正常乳腺组织相比，原发性乳腺癌组织中γ-氨基丁酸A 型受体相关蛋白（GABARAP）的mRNA 和蛋白水平较低，并且在低表达的乳腺癌细胞系中异位表达GABARAP 基因会降低肿瘤的生长速度。GABARAP 的这种抑瘤特性可以通过对自噬的直接作用和通过控制表皮生长因子（EGFR）[4-5]等受体的转运间接介导，提示GABARAP 可能与肿瘤的发生发展密切相关，但仍有很多争议。为此，本研究旨在探讨GABARAP 与老年胰腺导管腺癌根治术后预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2018年12月在复旦大学附属华东医院普外科行胰腺癌根治术并经病理证实为胰腺导管腺癌的老年病例60 例，其中男性40例，女性20 例；年龄60～84 岁,平均(68.7±5.9) 岁。所有病例均有完整的随访资料，随访的截止日期为2020年12月31日。排除标准为围术期死亡和切缘阳性的病例。60 例老年胰腺导管癌患者一般资料见表1。

表1 60 例老年胰腺导管腺癌患者临床资料

1.2 免疫组化 采用MaxVision 免疫组化法，检测标本取自于根治手术的胰腺癌组织以及配对癌旁正常胰腺组织。根据病理科档案选取包含肿瘤组织的蜡块及包含正常胰腺组织的蜡块数枚，分别切片，行HE 染色，显微镜下观察有无肿瘤组织及正常胰腺组织，选取肿瘤组织与非肿瘤组织界限分明、组织丰富的蜡块。将蜡块切片，且下的蜡块薄片轻轻放入漂烘仪热水中，使其漂浮，烫平，然后将蜡块薄片附着于载玻片上，待水流干，放65℃电热恒温箱中烘干1 h。选择Lumatas全自动免疫组化染色仪附带电脑内的染色程序，用标签打印机打印出标签，该标签与待执行的抗体模板相对应。将打印出的标签贴在已完成烤片的玻片一端，再将玻片放入染色仪的染色架上。将装有脱蜡液、一抗、二抗、DAB 的试剂盒放在试剂架上。将抗原修复液、缓冲液、酒精、蒸馏水放入仪器中相应容器内。进入仪器操作软件，扫描切片标签和试剂标签后，全自动免疫组化染色仪自行完成脱蜡、水化、修复、加入一抗、加入二抗、DAB 显色等步骤，运行结束后取出玻片。取下载玻片，用苏木精复染：清水冲洗，苏木素染色10～30 s，PBS 溶液、氨水或自来水返蓝。脱水：分别置入85%乙醇中、95%乙醇中及无水乙醇中，各浸泡3 min；透明：使用二甲苯进行透明封片：使用中性树胶封片。镜检。

1.3 GABARAP 阳性结果判定 阳性对照为已知胰腺癌阳性玻片，阴性对照为TW-0821 缓冲液代替GABARAP 鼠多克隆抗体。胰腺癌或癌旁胰腺细胞胞质中观察到棕黄色的颗粒，则判定为该细胞GABARAP 阳性。将切片置于400 倍镜下观察，结合细胞染色强度分析并计算呈棕黄色的阳性细胞个数与视野中所有细胞个数的比值，至少计算10 个视野，综合比值>25%判定该标本为阳性。

1.4 统计学分析 使用SPSS26.0 统计软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用检验；计数资料用例数和百分率表示， 组间比较采用卡方检验； Kaplan-Meier 和Log-rank 检验进行单因素分析，寻找可能影响胰腺癌导管腺癌预后的危险因素，采用Cox 回归模型分析筛选影响胰腺癌根治术后预后的因素。<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GABARAP 的表达及其与胰腺导管腺癌临床病理关系 GABARAP 在老年胰腺导管腺癌组织中的阳性表达率为58.3%（35/60）,而在癌旁正常胰腺组织中的阳性表达率为15.0%（9/60），差异有统计学意义（<0.001)（见图1）。而与肿瘤部位、肿瘤最大径、淋巴结转移、血管侵犯、神经侵犯、病理分级、肿瘤T NM 分期（AJCC2017）以及性别差异无统计学意义（均>0.05）。

图1 GABARAP 在胰腺癌及癌旁正常胰腺组织的免疫组化表达情况

2.2 胰腺导管腺癌根治术后预后情况 本研究中胰腺导管腺癌根治术患者共60 例，随访的截止日期为2020年12月31日,总共48 例患者出现复发转移，当中局部复发的比例为29.2%（14/48）,远处转移的比例为66.7%（32/48），局部复发和远处转移都有的患者的比例为14.6%（7/48）。60 例患者的无病中位生存期为17.7 个月，平均为（21.1±13.4）个月。现在仍有18 例患者存活，1 例失访。60 例患者中位总生存期为24.0 个月，平均为（24.3±12.4）个月。1年、2年、3年累计总生存率为80.0%、46.7%、32.6%。

2.3 GABARAP、临床病理因素（肿瘤位置、肿瘤最大径、淋巴结转移、病理分级、TNM 分期、性别和是否术后辅助化疗）与老年胰腺导管腺癌根治术后预后的关系 Kaplan-Meier 生存分析表明（见表2），Logrank 检验发现25 例GABARAP 阴性与35 例GABAR AP 阳性老年胰腺导管腺癌根治术后患者的无病生存期、总生存期差异均有统计学意义（分别为=0.023、=0.012，均<0.05）（见图2）。单因素生存分析提示：血管侵犯（=0.027）、神经侵犯（=0.044）同样与胰腺导管腺癌根治术后的无病生存期差异有统计学意义（<0.05)。同样，单因素生存分析结果表明辅助化疗（=0.016）亦与胰腺导管腺癌根治术后总生存期差异有统计学意义（<0.05)。

表2 GABARAP 与老年胰腺导管腺癌根治术后无病生存期、总生存期的关系

2.4 Cox 回归模型分析结果 Cox 回归多因素分析结果提示，GABARAP（=0.013)、血管侵犯（=0.016)与术后辅助化疗（=0.011) 与胰腺导管腺癌根治术后的无病生存期差异均有统计学意义（见表3）,但神经侵犯和胰腺导管腺癌根治术后的无病生存期差异无统计学意义。在总生存期上，GABARAP（=0.002)、血管侵犯（=0.034) 与术后辅助化疗（=0.001) 亦与胰腺导管腺癌根治术后总生存期差异有统计学意义。见表4。

表3 老年胰腺导管腺癌根治术后无病生存期危险因素Cox 回归模型多因素分析结果

表4 老年胰腺导管腺癌根治术后总生存期危险因素Cox 回归模型多因素分析结果

3 讨论

GABARAP是自噬相关蛋白Atg8 家族成员之一，是哺乳动物酵母Atg8 基因的同源物，其基因位于17号染色体17p13.1 的后链上，基因大小为1.5kb，该基因编码GABA（A）受体相关蛋白，在自噬过程中参与了自噬体的形成，相比于人体其他器官组织GABARAP 在胰腺组织中表达较少[6]。Joachim J 等[7]研究发现GABARAP在饥饿诱导的自噬激活中特异性地与ULK1 的LIR（LC3 交互区域）基序直接相互作用，从而促进了激活ULK复合物来维持自噬体的生长。与周围胰腺组织相比，大多数胰腺导管腺癌组织样本的血管相对较少。增殖的癌细胞比周围的非癌细胞需要更多的营养，尽管营养是通过功能结构上不成熟的新血管提供的。由于自主增殖的癌细胞经常暴露在缺氧条件下，自噬是缺氧应激下恶性转化的标志，研究推测胰腺癌细胞的重要过程可能是自噬，缺氧已被报道为胰腺癌预后不良的标志[8-9]。Yang S 等[10]研究表明胰腺癌依赖于自噬，胰腺癌的细胞系与原发肿瘤在基础的条件下自噬水平上升。自噬的遗传或药理抑制导致活性氧增加，DNA 损伤增加，代谢缺陷引起线粒体氧化磷酸化下降。在胰腺癌异种移植和遗传小鼠模型中，通过氯喹治疗或遗传手段遏制自噬可引起肿瘤的稳定消退和延长生存期。Fujii S 等[11]研究发现胰腺癌周围组织高水平自噬强烈提示患者不良的预后。以上研究提示自噬在胰腺癌发展过程中的促癌作用。然而当自噬被过度激活，大量大分子物质、细胞器等被降解也会导致细胞程序性死亡也是抑制胰腺癌细胞的一种方式。有研究表明吉西他滨及电离辐射等治疗措施可激活胰腺癌细胞自噬并诱导胰腺癌细胞自噬性死亡[12]。在最近的一项研究中,Rosenfeldt M T 等[13]用转基因的胰腺导管腺癌模型表明,TP53 突变存在时抑制自噬可促进癌症的形成，TP53 状态的表征将有助于识别新诊断的胰腺导管腺癌患者，他们可能从自噬抑制剂中获益最多。Miao Y 等[14]探讨了GABARAP 与结肠癌预后的关系，结果提示结直肠癌中GABARAP 表达升高与低分化、总生存期缩短相关，GABARAP 的高表达与预后有关，提示GABARAP 在结肠癌上可能为促癌基因。另外，有一项研究表明与正常乳腺组织相比，原发性乳腺癌组织中GABARAP的mRNA 和蛋白水平较低，并且在低表达的乳腺癌细胞系中异位表达GABARAP基因会降低肿瘤的生长速度，提示GABARAP 在乳腺癌上可能为抑癌基因[3]。如今的研究成果提示GABARAP表达可能与胰腺癌的自噬相关，因此本研究使用免疫组化的方法检测GABARAP 在老年胰腺导管腺癌组织和配对的癌旁正常胰腺组织的表达。

本研究结果表明GABARAP 在60 例老年胰腺导管腺癌组织中的阳性率（58.3%）高于在癌旁胰腺正常组织中的阳性率（15.0%），差异有统计学意义（<0.001）。目前尚无相关文献研究GABARAP 在胰腺癌及正常胰腺组织上的表达。所以，本研究推测GABARAP可能是老年胰腺导管腺癌的一个特异性的生物标志物，本研究进一步分析GABARAP 与临床因素的关系，探讨GABARAP 是否与老年胰腺导管腺癌术后复发转移相关。

本研究进一步将GABARAP表达分为阳性组和阴性组，探讨GABARAP 表达和胰腺导管腺癌根治术后的无病生存期、总生存期的相关性，结果显示GABARAP 阳性表达的胰腺导管腺癌患者的无病生存期（28.9±3.2）个月，高于阴性表达的患者（17.3±2.5）个月，GABARAP 表达阳性的胰腺导管腺癌患者的总生存期（34.5±3.1）个月，均高于阴性患者的（21.0±2.5）个月，差异有统计学意义（<0.05）。鉴于导致胰腺癌预后差的因素众多，进一步的胰腺癌预后关键因素的多因素回归分析，GABARAP 均是影响胰腺导管腺癌根治术后的无病生存期与总生存期的独立影响因素，而且GABARAP 表达水平和胰腺导管腺癌的预后相关，GABARAP阳性表达者无病生存期长，预后好。在本研究中,术后辅助化疗（=0.001) 和血管侵犯（=0.034) 也是胰腺导管腺癌根治术后患者无病生存期独立的影响因素。结合本研究结果，初步考虑GABARAP 为抑癌基因，与之前KlebigC 等[3]研究一致，GABARAP 在分子生物学层面具体通过自噬或其他机制抑制胰腺癌发展的作用机制，尚需进一步研究。胰腺癌好发于老年患者，年轻患者较少，故本研究着重研究GABARAP 在60 岁以上老年胰腺导管腺癌的表达情况，后续将扩大样本量，包括添加年轻胰腺癌患者样本加以研究。

综上所述，GABARAP 在老年胰腺导管腺癌组织中高表达，并与老年胰腺导管腺癌根治术后无病生存期、总生存期正相关，GABARAP 可能是预测老年胰腺导管腺癌预后的生物标记物，但GABARAP 具体通过哪些分子机制影响于胰腺导管腺癌还有待进一步的实验研究。