微小RNA加工剪切酶Dicer 1 rs1057035多态性与乳腺癌相关性研究

贾文远，芦延峰，冯 巍，刘彩媛，秦豪杰，潘新民

(1.河南科技大学法医学院，河南 洛阳 471000；2.河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471000)

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一，也是导致恶性肿瘤死亡的主要原因。2018年，约有210万新病例，死亡人数达60余万[1]。在发达国家，乳腺癌的5 a生存率为80%～90%，但在发展中国家却很差[2-3]。乳腺癌已知的危险因素包括吸烟、大量饮酒、人工流产、初潮年龄过早和外源激素摄入等[4-5]，而遗传因素亦在乳腺癌发病中发挥着极为重要的作用，其中微小RNA(micro RNA，miR)的作用近年来被逐渐加大研究。有研究[6]报道hsa-miR-146 rs2910164 GC和hsa-miR-196a2 rs11614913 CT基因型可能与北印度女性人群乳腺癌易感性相关。MiR-323b rs56103835 TT基因型增加了患者乳腺癌的发病年龄[7]。Bahreini等[8]的研究显示，miR-559 rs58450758隐性基因型(TT)在乳腺癌患者中(23.3%)多于对照组(2%)，非显性基因型(CT+TT)与乳腺癌易感性相关，生物信息学分析提示rs58450758可能改变了miR-559二级结构，在miR前体区中形成新的Dicer位点。而miR加工剪切酶的遗传变异，如位于Dicer1基因3’-UTR的rs1057035降低了结直肠癌和慢性淋巴细胞白血病的发病风险[9-10]。因此，本研究分析miR加工剪切酶Dicer1rs1057035多态性，探讨其与中国汉族人群乳腺癌的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2017年1月至2019年12月河南科技大学第一附属医院的女性乳腺癌患者176例，年龄(50.73±11.07)岁。纳入标准：1)女性；2)确诊乳腺癌时无其他部位原发性肿瘤；3)病理诊断为乳腺导管癌；4)民族为汉族。排除标准：有乳腺癌家族史者。收集患者的临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)等临床资料。2019年6月至12月河南科技大学第一附属医院的健康体检女性216例，年龄(41.28±10.32)岁，民族为汉族，排除乳腺癌家族史者。

1.2 仪器与试剂ABI-9700型聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(美国Thermo Fisher公司)；测序仪(美国Thermo Fisher公司)；D3024型台式离心机(北京大龙兴创实验仪器股份公司)；DYY-Ⅲ28A型垂直电泳仪(北京六一仪器厂)。全基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Taq酶购自宝生物工程大连有限公司；扩增引物购自上海百力格生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取 按试剂盒操作说明提取全基因组DNA。

1.3.2 基因分型Dicer1rs1057035扩增引物：5’-TGCAGTTGCTTTTTCAAGACA(上游)，5’-TGCAATGTGAGACCGAATGT(下游)。经过3轮PCR扩增，电泳后切胶纯化，对纯化后产物进行测序，操作步骤按说明书进行。

1.4 统计学处理采用SPSS 20.0处理数据，直接计数法计算Dicer1rs1057035不同基因型在2组研究对象中的分布，用χ2检验分析基因型分布是否符合Handy-Weinberg平衡，以比值比(odds ratio,OR)和95%置信区间(confidence interval,CI)表示与乳腺癌风险之间的相对风险，检验水准α=0.05。

2 结果

Dicer1rs1057035在女性乳腺癌和健康体检女性中基因型分布符合Handy-Weinberg平衡，在女性乳腺癌患者和健康体检女性中的差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。Dicer1rs1057035等位基因T、C和基因型分布TT、CT、CC乳腺癌患病风险差异均无统计学意义(P均>0.05)(表2)。Dicer1rs1057035基因型分布与乳腺癌ER、PR、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移无关(P均>0.05)(表3)。

表1 2组Dicer 1 rs1057035等位基因、基因型分布比较 n(%)

表2 Dicer 1 rs1057035不同等位基因、基因型分布乳腺癌患病风险比较

表3 Dicer 1 rs1057035基因型分布与乳腺癌临床病理特征的关系 n(%)

3 讨论

MiR在细胞核内经过多种酶加工剪切成为前体，出细胞核后进一步加工成为成熟体，通过与靶RNA的3’-非翻译区(3’-UTR)内的序列碱基配对，负向调节mRNA和蛋白翻译。虽然miR不编码蛋白质，但是作为调控分子参与乳腺癌的病理生理过程，包括细胞增殖、凋亡、分化、发育、代谢、侵袭、迁移和血管生成等。本课题组前期系统评价了miR前体区的单核苷酸多态性与乳腺癌的关系，发现位于has-miR-196a2前体区的rs11614913多态性增加了乳腺癌的发病风险[11]。

Dicer1为miR加工剪切酶，在RNaseⅢ家族中对miR或小干扰RNA的产生起着至关重要的作用。Dicer及生成的miR与肿瘤又有着密切关系[12]。如Dicer1热点区域突变为卵巢特征性的分子病理改变[13]，人乳腺癌细胞株MCF-7Dicer1表达明显低于正常乳腺上皮细胞MCF10A，过表达miR-186的MCF-7细胞中Dicer1表达明显升高，说明miR-186通过靶向正调控Dicer1表达，抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的侵袭、迁移能力[14]。

沉默Dicer1表达，能够抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移，阻滞细胞周期分布，促进卵巢癌细胞凋亡[15]，Dicer基因低表达肿瘤更常表现出恶性程度高和预后差的特点[16]。而miR-590-3p在鼻咽癌中可通过靶向上调Dicer1表达，降低N-钙黏蛋白的表达，进而抑制鼻咽癌细胞的侵袭、转移能力[17]。有报道脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶可以降低二甲基苯蒽诱导的乳腺癌中miR-18a和基质金属蛋白酶-9的表达并增加Dicer1的表达[18]。而miR-208a对乳腺癌和乳腺癌干细胞均有调控，以miR-208a-SOX2 /β-catenin-LIN28-let-7a-Dicer1调控反馈环在乳腺癌干细胞更新中发挥作用[19]。

曹文明等[20]研究65例乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)/BRCA2阴性家族性乳腺癌和100例健康女性发现，Dicer1rs2297730的G等位基因和A/G基因型在乳腺癌中的分布频率显著高于健康女性(OR=1.87,95%CI:1.17～2.99,P=0.008;OR=3.13,95%CI:1.56～6.29,P=0.004)。MiR-191/425簇与Dicer1的3’-UTR区结合，抑制Dicer1的表达，损害miR合成。通过miR-191或miR-425的强制表达，可刺激乳腺癌细胞的存活、增殖、迁移和侵袭；而抑制miR-191/425导致Dicer1的表达下调，则减轻了乳腺癌细胞的致癌性。此外，miR-191/425簇在体内实验促进了乳腺肿瘤的生长、侵袭和转移[21]，而且致癌的miR-146b也使Dicer1表达下调[22]，这些为基于RNA治疗各种恶性肿瘤的方法(包括miR抑制剂)提供了思路。

ER、PR等免疫组化指标的异常表达检测对乳腺癌具有辅助诊断和预后评估价值[23]。而且，有报道三阴性乳腺癌术后辅助化疗采用含铂方案疗效优于非含铂方案，且安全性良好[24]。促性腺激素释放激素激动剂对激素受体阴性年轻乳腺癌辅助化疗患者卵巢功能具有保护作用[25]，因此乳腺癌临床病理特征与辅助治疗和预后评估有关。但本研究中Dicer1rs1057035与乳腺癌ER、PR、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移相关性分析未见显著性差异。而且，本研究中Dicer1rs1057035不同基因型在女性乳腺癌人群和健康女性人群中也未观察到显著性差异。分析其原因：第一，可能是本研究样本量不足，暂无法排除假阴性的结果；第二，乳腺癌发病是多因素交互作用的结果，本研究未考虑其他分层因素的影响；第三，本研究属于回顾性研究，不可否认存在样本入选偏倚的风险。因此，未来可考虑大样本前瞻性研究验证本结果。

综上所述，Dicer1rs1057035多态性与中国汉族人群女性乳腺癌发生和乳腺癌ER、PR、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移等无关。进一步开展大样本及不同种族的验证性研究，有助于阐明Dicer1基因多态性对乳腺癌发病的影响。