构建乳腺癌免疫相关长链非编码RNA预后风险模型

肖 冉，杨 盟，丁茹梦，谭远远，李朵璐

(1.郑州大学第一附属医院药学部,河南 郑州450052；2.郑州市第七人民医院心血管内科,河南 郑州 450006)

乳腺癌(breast cancer,BRCA)是女性最多发的肿瘤之一，是女性死亡的主要原因，其发病率逐年上升[1-2]。随着诊疗水平的提高，BRCA的死亡率显著降低，但由于BRCA的高异质性，手术和化疗仍是其主要的治疗手段[3-4]。有研究报道，BRCA患者的预后与机体免疫力有关[5-7]。因此，有必要寻找与免疫相关的预测因子来改善BRCA的预后。长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指转录长度超过200 nt的主要非编码RNA类型[8]，其参与肿瘤的发生、发展和肿瘤的免疫应答，并可导致不良预后[9]。干扰lncRNA的表达能够改变肿瘤的实际情况，已在多种癌症类型中得到广泛认可[10]。而免疫相关lncRNA在乳腺癌预后中的作用尚不明确，因此，本研究拟探索免疫相关lncRNA与BRCA患者预后的关系，为临床诊断和治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 数据下载从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中获得了BRCA的转录组RNA测序数据和临床病理数据，包含113个非肿瘤组织和1 039个BRCA组织。收集并提取了患者的临床病理数据(不包括总生存时间≤30 d的患者)。数据更新于2020年7月11日。

1.2 鉴定免疫相关的lncRNA结合ImmLnc数据库(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/ImmLnc)，筛选出BRCA免疫相关lncRNAs。单因素Cox回归分析获得了10个与免疫相关的lncRNA的预后(P<0.05)。根据AIC确定最优的预测模型，建立免疫相关的lncRNAs模型(P<0.05)。计算每例患者的风险评分，公式如下：风险评分=Exp1×lncRNA1 + Exp2×lncRNA2 +…+ Expi×lncRNAi，其中Expi是样本中每种免疫相关lncRNA的相对表达量，lncRNAi是多元分析模型的回归系数。

1.3 模型评价及临床病理参数分析根据中位风险评分，将BRCA患者分为高风险组和低风险组。通过Kaplan-Meier生存分析比较2组之间的差异。并构建受试者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲线进一步验证该模型的预测能力。结合TCGA数据库中乳腺癌患者的临床病理资料，用箱式图验证该模型中的lncRNA与BRCA患者T分期的关系。

1.4 统计学处理采用R 3.5.1处理数据，用单因素和多因素Cox回归分析筛选与乳腺癌预后相关的lncRNA，建立风险模型，并用Kaplan-Meier生存分析和受试者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲线检验该模型的辨别力,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫相关lncRNA的获取从TCGA数据库得到368个差异表达的lncRNA。通过与ImmLnc数据库中BRCA的lncRNA基因集进行匹配，选出了128个免疫相关的lncRNA。

2.2 免疫相关lncRNA对预后的影响单因素Cox回归分析显示，10个lncRNA(包括LINC00578、LINC01614、LINC00987、HOXB-AS1、HOXB-AS1、LINC00667、SH3BP5-AS1、MIR4435-2HG、LINC01235和HOTAIR)与BRCA患者的预后相关(P<0.05)。将以上变量(P<0.05)纳入多因素Cox回归分析，最终筛选出3个lncRNA(即LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667)是BRCA患者预后的独立预后因素，以此建立与BRCA患者免疫相关lncRNA预后模型，根据中位风险评分将BRCA患者分为高风险组(模型评分>1.037 6)和低风险组(模型评分≤1.037 6)。Kaplan-Meier生存曲线表明，高风险组的生存时间明显短于低风险组的生存时间(P<0.001)。低风险组和高风险组的5 a生存率分别为87.8.0%(95%CI：83.6%～92.1%)和76.2%(95%CI：70.7%～82.3%)。ROC曲线分析显示，曲线下面积为0.706(95%CI：0.676～0.771，P<0.001)，具有良好的BRCA患者预后的辨别力。见表1、2，图1、2。

图1 高风险和低风险组的风险评分(A)和Kaplan-Meier生存曲线(B)

图2 该模型预测BRCA患者的ROC曲线

表1 BRCA患者预后相关免疫相关lncRNA的单因素Cox回归分析结果

2.3 该模型与临床病理特征的关系为了进一步验证该模型与临床病理特征的关系，我们从TCGA数据库下载1 039例BRCA患者的临床病理资料。用箱式图分析显示，LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667与T分期关系密切(P<0.05)。见图3。

图3 3个免疫相关lncRNA与T分期的关系

表2 BRCA患者预后相关免疫相关lncRNA的多因素Cox回归分析结果

3 讨论

BRCA是高度异质性的恶性肿瘤，其具有基因组和遗传多样性的特点[11]。近年来，针对免疫检查点的程序性死亡受体-1、程序性死亡受体-配体1抑制剂等新兴免疫治疗方法在肿瘤治疗中发展迅速，并取得了一定的疗效[12]。免疫治疗在乳腺癌的治疗中有广泛的前景。然而，目前乳腺癌的治疗仍有很大的改善空间，晚期BRCA患者的预后仍不理想。因此，有必要对BRCA的治疗提出新的策略。基于这些现状，我们从TCGA数据库中提取BRCA的转录组测序数据。由于lncRNA在机体的各种生物过程中发挥着广泛的调控作用[9,13-14]，因此我们将研究重点放在lncRNA上，试图找到免疫相关lncRNA，并建立预后模型。

由于肿瘤分子特征的复杂性，多种生物标志物能够提高预后的准确性。本研究中，我们使用单因素Cox回归分析筛选出10个与BRCA患者预后相关的免疫相关lncRNA。多因素Cox回归分析鉴定出3个免疫相关lncRNA是BRCA患者独立的预后因子，并建立BRCA患者的预后风险模型。该模型能够较好预测BRCA患者的预后。且该模型在评估患者生存上有一定的优势。为了检测该模型在临床应用中的可行性，我们进一步联合患者的临床病理特征，验证了模型中3个免疫相关lncRNA与临床病理特征的关系。其可能与乳腺癌的恶性发展有关。

本研究中发现，lncRNA LINC00578在乳腺癌T分期晚期的患者中高表达，而NIFK-AS1和LINC00667的表达减少。查阅文献发现，在这3个lncRNAs中，LINC00578与乳腺癌的自噬和乳腺癌干细胞相关[15-16]。NIFK-AS1的过表达抑制能够子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭[17]。这些研究也进一步证实上述模型在BRCA患者预后中的价值。

综上所述，我们证明了LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667等3个与免疫相关的lncRNA作为BRCA患者的预后模型，为免疫有关的研究和治疗策略提供新的依据。然而，我们的研究仍有一些不足：首先，该研究是基于TCGA数据库的一项探索性研究，患者信息更新不及时、检测手段不一等均会影响数据的准确性。检测本模型的有效性，仍需通过现实生活中的临床病理资料进一步验证。其次，尽管我们阐明了这些lncRNA在BRCA患者中的预后作用，他们作为免疫相关预后标志物的潜在机制尚不清楚，仍需进一步的广泛验证。