响应曲面设计优化牛初乳中乳铁蛋白的超滤提取工艺

刘佳欣，贺梦瑶，朱建星，张万忠

沈阳化工大学制药与生物工程学院（沈阳 110142）

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种铁结合性糖蛋白，相对分子质量约为80 kDa[1]，最早是由Sorensen（1939）在牛乳中一个未知的“红色组分”中发现的[2]。乳铁蛋白在乳中的含量最为丰富，特别是在初乳中含量较高，人初乳中乳铁蛋白的质量浓度可达到7 mg/mL，牛初乳中乳铁蛋白的质量浓度平均为1 mg/mL[3]。乳铁蛋白作为多功能糖蛋白具有多种生物活性，如抗病毒、抗癌、抗氧化、调节机体免疫反应[4]，还具有抑菌功能，对肠道菌群有一定的调节作用[5]。

超滤是一种基本的膜分离技术，其原理是根据不同的膜孔径，分离出不同分子质量和形状的大分子物质。超滤操作简便，易于形成大规模工业生产[6-7]。试验采用超滤膜截留相对分子质量100 kDa的装置，首先对膜通量和膜效率的单因素（料液温度、操作压力、料液pH）进行优化，在单因素结果的基础上采用响应曲面法（RSM），借助实验设计软件（Design-Expert version 8.0.6），以膜通量为响应值，对超滤提取牛初乳中乳铁蛋白的工艺进行优化，以得到最佳的提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛初乳，丹东振兴区奶户提供；95%乳铁蛋白，Biotopped公司；盐酸，无锡市亚盛化工有限公司；pH精密试纸，沈阳富阳特种纸业有限公司。

1.2 仪器与设备

小型切向流超滤装置，美国Millipore公司；PelliconXL装置，美国Millipore公司；高速冷冻离心机，株式会社日立制作所；HH4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；FA2204B型电子精密天平，天美（中国）科学仪器有限公司；循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将牛初乳装入100 mL离心管中，以10000 r/min 4 ℃离心30 min，除去上层脂肪；加入1 mol/L的稀盐酸，缓慢添加调至牛初乳溶液pH 4.6，水浴加热40 ℃，保温30 min，然后放入高速冷冻离心机中，以10000 r/min 40 ℃离心30 min，保留上层乳清蛋白，得到乳清蛋白溶液；进行抽滤，得到的粗样品用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得到纯净的样品。

1.3.2 超滤

准确量取100 mL样品溶液，加入100 mL经过0.22 μm微孔滤膜过滤的蒸馏水，按1∶1稀释，倒入料液缸中，采用规格为100 kDa的PelliconXL装置，进行超滤试验，收集透过液，测定膜通量和乳铁蛋白含量，计算膜效能。

1.3.3 标准乳铁蛋白溶液的配制

精确称取0.01 g纯度为95%的乳铁蛋白标准品，用0.15 mol/L NaCl溶液定容至100 mL，配成质量浓度为100 μg/mL标准乳铁蛋白溶液。选用0.22 μm的微孔滤膜过滤。

1.3.4 乳铁蛋白标准曲线绘制

取9支试管，分别加入0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 mL的乳铁蛋白标准品溶液（质量浓度为100 μg/mL），用0.15 mol/L NaCl溶液补足到10 mL，混合均匀，30 min内以0管为空白对照，以不同质量浓度的乳铁蛋白为横坐标，475 nm处的乳铁蛋白吸光度为纵坐标，绘制乳铁蛋白吸收度标准曲线。

1.4 计算方法

1.4.1 膜通量的计算

膜通量：单位时间透过单位膜面积的渗透液流量。按式（1）计算。

式中：JW为膜通量，L/（m2·h）；V为透过液总体积，L；A为膜有效面积，m2；t为过滤时间，h。

1.4.2 膜效能的计算

膜效能：单位时间内透过单位膜面积的乳铁蛋白质量。按式（2）计算。

式中：Me为膜效能，g/（m2·min）；m为透过液中质量，g；A为膜面积，m2；t为时间，min。

1.5 单因素试验

单因素试验以料液温度25 ℃、操作压力0.25 MPa、料液pH 7为基本条件，通过改变单一因素来探讨其对膜通量和膜效能的影响。料液温度25，30，35，40，45和50 ℃；操作压力0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 MPa；料液pH 4，5，6，7和8。

1.6 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken响应面试验设计原理，采用Design-Expert软件，以膜通量为影响值进行响应面优化，响应面因素和水平见表1。

表1 响应面因素和水平表

1.7 数据分析

所有试验设置3次重复，并通过SPSS 17.0软件统计进行数据方差分析，p＜0.01表示差异具有显著统计学意义，试验结果用作图软件Origin 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 乳铁蛋白标准曲线

乳铁蛋白吸光度标准曲线见图1。乳铁蛋白吸光度标准曲线回归方程为y=0.00898x+0.28363，R2=0.9995。

图1 乳铁蛋白标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液温度对膜通量和膜效能的影响

由图2可知，当料液温度升高时，膜通量和膜效能也随之升高。当料液温度为35 ℃时，膜通量达到最大值。这是因为蛋白质的热变性受温度的影响，导致溶解度发生变化，从而使膜通量随温度的升高而增加。当温度大于35 ℃时，膜通量和膜效能开始下降，这是因为加热之后乳清蛋白的稳定性降低，甚至发生蛋白质变性，蛋白质沉淀下来，不能透过超滤膜，超滤膜产生堵塞，从而导致膜通量降低，乳铁蛋白的含量降低，因此导致膜效能降低[9]。

图2 料液温度对膜通量和膜效能的影响

2.2.2 操作压力对膜通量和膜效能的影响

由图3可知，当操作压力不断增大时，膜通量也随之增大，膜效能呈现先增大后减小的趋势。当操作压力为0.25 MPa时，膜效能达到最大值。 根据速率衰减模型解释说明，当压力较低时，超滤膜的阻力、黏度都处于恒定状态，膜通量的大小与压力呈正相关；当操作压力超过0.25 MPa之后，膜通量增长缓慢，基本保持不变，根据凝胶层阻力模型和浓差极化进行解释说明，由于超滤膜污染严重，蛋白质分子能在膜之间形成一定的阻力，导致溶液中的其他分子不能通过超滤膜，因此膜通量和膜效能 的大小发生改变[10]。

图3 操作压力对膜通量和膜效能的影响

2.2.3 pH对膜通量和膜效能的影响

由图4可知，随着料液pH的大小逐渐升高，膜通量和膜效能的变化为先下降后先上升，最后下降。当料液pH为5时，膜通量和膜效能都处于最低状态，这是因为乳清蛋白的等电点大多分布在pH 5.0左右，如α-乳白蛋白等电点在4.8左右，β-乳球蛋白等电点在5.1～5.3之间。此时蛋白质荷电性和溶解度最低，乳清蛋白易于发生聚集，在超滤膜表面和膜孔内沉积，膜孔堵塞，导致大量乳铁蛋白被截留，因此膜通量和膜效能降低[11]。当料液pH 7时，膜通量和膜效能达到最大值。当pH继续升高，达到8时，膜通量和膜效能开始下降，原因可能是溶液环境达到乳铁蛋白等电点，乳铁蛋白容易形成沉淀，不能通过超滤膜，超滤膜产生堵塞，导致膜通量降低，乳铁蛋白的含量降低，从而导致膜效能下降[12]。

图4 料液pH对膜通量和膜效能的影响

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 回归模型的构建及方差分析

膜通量提取试验设计方案以及结果见表2，回归方差分析见表3。拟合所得的多元二次回归方程为Y= 7.42+0.14A+0.35B-0.012C-0.025AB-0.10AC+0.13BC-0.41A2-0.34B2-0.21C2。

表2 响应面试验设计和试验结果

由表3可知，该回归模型达到极显著水平（p＜ 0.01），说明该方法是可靠的；失拟项不显著，R2= 0.9753，表明此模型的拟合程度良好，膜通量可以用该模型进行分析和预测。通过对比表3中的F值可以看出，影响膜通量的主次顺序为B＞A＞C，即操作压力＞料液温度＞料液pH。

表3 回归模型方差分析表

2.3.2 各因素之间的交互作用

根据回归方程做出的两两因素交互作用的响应面分析图见图5。压力（B）和pH（C）交互作用对膜通量的影响显著。

图5 各两因素交互作用的响应面

2.3.3 最优条件的确定及验证实验

用Design-Expert 8.0.6软件对二次多项式回归方程进行计算，得到膜通量的最优制备工艺条件：料液温度34.7 ℃，操作压力0.28 MPa，料液pH 7.05；此时膜通量为7.50481 L/（m2·h）。按照此条件进行验证试验，得到的膜通量为7.65 L/（m2·h），与理论值的相对误差为1.93%，说明该制备方法具有一定的实际可操作性。

3 结论

乳铁蛋白作为一种新兴功能性食品配料，具有很高的营养价值。近年来，乳铁蛋白的提取纯化工艺和应用在不断提高，已成功应用于酸奶、婴幼儿配方奶粉[13]等产品中。试验以牛初乳为原料提取乳铁蛋白，通过响应面法进行试验设计、分析及优化，得到最优提取条件：料液温度34.7 ℃，操作压力0.28 MPa，料液pH 7.05，此时膜通量为7.65 L/（m2·h），与模型预测的膜通量相吻合，认为此次试验模型的设计是可行的。响应面法优化的最优提取工艺高于均匀和正交设计，说明响应面法能较好地反映各试验因素的交互作用，是一种优于均匀与正交设计的方法[14]。综上，利用响应面法对超滤法提取牛初乳中乳铁蛋白的提取工艺的优化是科学可靠的，该试验为从牛初乳中提取乳铁蛋白以及对乳铁蛋白的开发利用提供理论依据。