酶联免疫法检测牛乳中A1β-酪蛋白研究

艾正文

乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院（上海 200436）

牛乳中的蛋白质主要分为乳清蛋白和酪蛋白，其中酪蛋白约占牛乳中蛋白质的80%[1]。牛乳中的酪蛋白主要由as1-酪蛋白、as2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成。根据文献资料显示，发现的β-酪蛋白变异体达十几种，较为常见的变异体为A1、A2、B和C。其中，又以A1和A2这2种变异体最为常见，其他变异体出现的概率很低。A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的区别在于第67号位的氨基酸种类不同[2-3]。有研究表明，A1型β酪蛋白经消化后会产生一种含有7个氨基酸的短肽，即β-酪啡肽（BCM-7）[4-5]，而这种短肽可能会引起某些诸如过敏[6]、糖尿病[7]、消化吸收[8]等非传染性疾病，而A2型β-酪蛋白则不会产生这种β-酪啡肽。通过基因测序手段可以实现A2基因型奶牛的有效筛选。近年来随着A2牛奶及A2奶粉等乳制品的兴起，A2乳制品的相关研究日渐增多。关于A1和A2蛋白检测方法的研究越来越多，综合研究发现乳制品中β-酪蛋白的检测方法主要有液相法[9]、高分辨质谱法[10]、毛细管电泳法[11-12]及免疫学方法[13-14]等，但是这些方法在便利性、准确性及成本等方面存在一定程度不足。正是标准的检测方法的缺失，如何快速检测乳制品中A1蛋白成为需要重点解决的问题。

酶联免疫法由于其方便和灵敏等优点，特别是在工业生产过程中由于其能够在相对较短的时间内得到检测结果，因此被广泛应用到实际生产中。试验对一种牛乳中A1β-酪蛋白含量的酶联免疫检测方法进行验证，以探讨该方法在实际应用的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通巴氏杀菌乳（O_PMilk，含有A1 & A2β-酪蛋白）；A2β-酪蛋白生牛乳（A2_RMilk，取自A2牧场）；A2β-酪蛋白鲜牛奶（A2_PMilk，采用质谱方法验证）；盐酸（化学纯，国药集团）；氢氧化钠（化学纯，国药集团）；牛乳A1β-酪蛋白酶联免疫试剂盒（biosensis）；去离子水。

1.2 仪器与设备

摇板机L079-100（Thermo）；移液器（Eppendorf）；酶标仪SpectraMax M5（Molecular Devices）；Milli-Q超纯水仪（美国密理博公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液的配制

将100 mL TBS（10X）加入900 mL去离子水中，充分混合并定容，用0.45 μm孔径滤膜过滤得到TBS缓冲液（1X）。

取1 mL Tween-20溶液加入TBS缓冲液（1X）中，充分混合后得到TBST溶液，用于配制抗体稀释液缓冲液和洗板溶液。

将100 mL TBST加入试剂盒中BSA瓶中充分混合，但不要过度混合，制备抗体和样品Ab稀释缓冲液。

标准品的制备：将试剂盒中标准品储备液加入990 μL稀释缓冲液，制成400 ng/mL A1标准品。逐渐稀释配制成质量浓度200，100，50，25和12.5 ng/mL的A1标准品。稀释好的标准溶液置于4 ℃条件下保存，于3 h内使用。

样品的制备：将待测的普通巴氏杀菌乳样品在0.5 mol/L NaOH中按照1∶100稀释，用Ab稀释缓冲液再稀释至最终稀释倍数1∶100000。同时，将待测的A2牛奶样品稀释至最终稀释倍数1∶1000。稀释的样品在4 ℃条件下保存，并于3 h内完成测试。

1.3.2 标准曲线的建立

按照biosensis A1β-酪蛋白酶联免疫检测试剂盒说明书操作方法，将试剂盒中A1β-酪蛋白标准品配制成一定的浓度梯度，在450 nm条件下进行测定，以标准品的浓度梯度为横坐标，标准品的吸光度为纵坐标，构建四参数曲线，得到线性回归方程。

1.3.3 方法重复性

在相同试验条件下，取10 μL相同批次的N_PMilk样品，根据步骤1.3.1中所述的样品制备方法稀释至1∶100000，进行7次平行试验，计算7次试验结果的相对标准偏差，相对偏差小于10%说明重复性较好[15]。

1.3.4 试剂盒交叉反应验证

分别取10批次O_PMilk、 5批次A2_RMilk及5批次A2_PMilk，使用试剂盒方法进行检测，以确定A1β-酪蛋白酶联免疫试剂盒对A2β-酪蛋白是否有交叉反应。

1.3.5 数据处理

试验数据采用Excel 2010软件进行计算和统计。四参数曲线采用ELISA Calc软件进行拟合。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按照试剂盒使用说明配制12.5～400 ng/mL质量浓度梯度的A1β-酪蛋白溶液标准品并检测其A450值，得到的吸光度及标准曲线见表1和图1。由图1所示，y=（0.92396-0.09188）/[1+（x/95.25601）-0.84058]+ 0.09188，r2=0.99148。A1β-酪蛋白标准曲线r2值超过0.99，曲线表现出良好拟合性。

表1 A1β-酪蛋白标准曲线测定

图1 A1β-酪蛋白标准曲线

2.2 方法重复性验证

用A1β-酪蛋白酶联免疫试剂盒对O_PMilk样品中A1β-酪蛋白含量进行测定，设置7次平行试验。对7次测得的数据进行相对偏差计算，以检测该方法的重复性是否良好，试验结果见表2。在相同检测条件下，A1β-酪蛋白酶联免疫法检测A1蛋白具有良好重复性，7次重复检测的相对标准偏差为4.97%（n=7）。SRSD小于10%，表明该方法重复性较好。

表2 样品重复性检测结果

2.3 交叉反应验证

为验证A1β-酪蛋白酶联免疫法对牛乳中A2β-酪蛋白是否有交叉反应，分别对多批次O_PMilk、A2_RMilk及A2_PMilk样品中A1蛋白进行检测，检测结果如表3所示。

表3 不同牛奶样品中A1β-酪蛋白检测结果

10批次的普通巴氏杀菌乳中由于同时含有A1和A2β-酪蛋白，因此10批次O_PMilk样品中均可以检测到不同浓度的A1β-酪蛋白存在，而5批次A2_RMilk和A2_PMilk样品中均未检测到A1β-酪蛋白。同时，A2_PMilk样品经过高分辨质谱方法检测证明也无A1蛋白存在，说明这与检测结果十分吻合。因此，试验结果表明A1β-酪蛋白酶联免疫法对牛奶中A1β-酪蛋白具有良好的特异性，与A2β-酪蛋白无明显的交叉反应。

3 结论

A1β-酪蛋白没有标准检测方法，报道的研究方法在便利性和经济成本等方面存在劣势。研究表明，A1β-酪蛋白酶联免疫试剂盒法对A1β-酪蛋白的检测具有良好线性，线性范围为6.25～400 ng/mL，重复性试验结果表明相对偏差为4.97%，重复性良好。同时，试剂盒方法对A1β-酪蛋白具有良好的特异性。但是，由于无法获得商业的A1β-酪蛋白标准品，因此无法对A1β-酪蛋白酶联免疫试剂盒方法进行定量限和回收率的验证。同时，由于试剂盒保存期限较短，整个检测等待时间较长，并且对运输和测试环境比较敏感，因此该方法仍有待进一步完善。该方法可作为一种检测手段，用于牛奶中A1β-酪蛋白的定性研究。