蒸汽爆破超声波复合提取灵芝多糖及抗氧化活性

张博华，张明，范祺，王崇队，杨立风，马超

中华全国供销合作总社济南果品研究院（济南 250014）

灵芝（Ganoderma lucidum）属于担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌，在中国及亚洲国家是一种十分受欢迎的药用真菌[1]。灵芝含有多种生物活性组分如灵芝多糖、三萜、甾醇类、多种蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿质元素等[2]。灵芝多糖（GLP）是灵芝的主要生物活性组分，具有抗癌、免疫调节、降血脂、抗氧化等多种药理作用[3]。近来越来越多的灵芝多糖产品作为功能食品出现在市场上。人体代谢过程中会产生活性氧类物质，可导致癌症、冠心病、动脉硬化等疾病，所以清除活性氧类物质对人体非常重要。灵芝多糖在清除活性氧方面可展现良好的抗氧化活性，是一种天然抗氧化原料[4]。

随着健康意识的增强，对灵芝的需求不断增加，但野生灵芝资源稀少，灵芝主要通过人工种植获得。人工种植的灵芝大量用于灵芝孢子粉的培育，对灵芝子实体应用的研究也越来越多[5]。

蒸汽爆破技术（简称汽爆技术）是指在高压密闭环境中，用过热蒸汽将物料加热到180～235 ℃，维持压强数秒或数分钟后瞬间泄压，随着压强骤降、水分汽化，气体迅速膨胀，固体物料受机械力作用结构受到破坏，物料产生爆破效应的一种物理处理方法[6-8]。灵芝成熟后成木栓质，表面有蜡质，有大量纤维束组成，蒸汽爆破技术主要应用于纤维含量较高的物料，可以提高灵芝子实体中多糖的溶出率，以及增香的效果[9]。试验主要为确定最优汽爆处理灵芝子实体提取的工艺、汽爆对灵芝子实体纤维的影响、汽爆对灵芝多糖的抗氧化活性的影响。对灵芝多糖选取提取超声时间、汽爆保压时间、汽爆压强3个单因素样品进行蒸汽爆破，测定不同条件下灵芝子实体的粗多糖的得率，并据此进行正交试验确定灵芝子实体粗多糖的最佳改性工艺，从而提高灵芝子实体粗多糖提取率。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

1.1.1 原料

灵芝子实体（山东冠县广义灵芝养殖专业合作社）。

1.1.2 试剂

无水乙醇、水杨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、H2O2、三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；DPPH（麦克林试剂有限公司）。

1.1.3 仪器

QBS-80型蒸汽爆破设备（鹤壁政道启宝实业有限公司）；SHA-B双功能水浴恒温振荡器（苏杰瑞尔电器有限公司）；RXH-B-1热风循环烘箱（江阴市宏达粉体设备有限公司）；标准检验筛60目浙江上虞市金鼎标准筛具厂；TGL-10B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；RH-600A高速粉碎机（永康市荣浩工贸有限公司）；MB23水分测定仪（奥豪斯仪器（上海）有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 灵芝子实体粗多糖的测定

灵芝子实体粗多糖的测定参照NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的测定》所述方法进行测定

1.2.2 蒸汽爆破灵芝子实体单因素试验

取灵芝子实体切片100 g，隔夜复水调整物料含水率至30%，汽爆后物料置于60 ℃条件下干燥至物料水分10%以内，用高速粉碎机对干燥残渣进行打粉，粉体过60目筛，即为测试样品。以未经蒸汽爆破处理的灵芝子实体粉为空白对照。依次比较不同蒸汽爆破压强（0.3，0.6，0.9，1.2，1.5和1.8 MPa），不同蒸汽保压时间（30，60，90，120，150和180 s），不同提取时间（10，20，30，40，50和60 min）对灵芝子实体提取率的影响。

1.2.3 扫描电镜（SEM）分析

将处理后的灵芝子实体样品于60 ℃烘箱中干燥至恒质量，然后采用溅射镀膜法进行表面镀金，对其进行电镜扫描观察拍照，得到不同倍数的扫描电镜图片。

1.2.4 抗氧化活性的测定

将提取的灵芝子实体多糖分别制备成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mg/mL的样品溶液。同样质量浓度配制VC溶液备用。进行DPPH自由基清除活性和还原能力的测定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性测定[10]

取2 mL样品溶液和2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液放入试管中，充分混合后避光静置30 min，在517 nm处测定其吸光度A1。同法测定2 mL样品溶液和2 mL无水乙醇混匀后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸馏水的吸光度A0，同时用VC标准品作为对照。

1.2.4.2 羟自由基清除能力测定[11]

测定方法参照曾军[11]的方法，量取1.8 mmol/L的FeSO42 mL放入试管中，加入1.8 mmol/L水杨酸1.5 mL，加入不同浓度样品溶液1 mL，加入0.03% H2O20.1 mL并启动整个反应，37 ℃反应30 min后，2000 r/min离心10 min，以蒸馏水代替样品溶液做空白参比，在510 nm测定吸光值。

1.2.4.3 还原力测定[12]

取0.5 mL不同浓度的可溶性灵芝粗多糖样品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6、0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液62.5 mL+0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液37.5 mL）和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃温度水浴保温20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液、5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%氯化铁溶液，混合均匀，静置10 min，以无水乙醇代可溶性灵芝粗多糖提取液按上述处理作空白对照，于700 nm波长处测定吸光度。

1.3 蒸汽爆破灵芝子实体多糖提取正交优化试验

在单因素试验的基础上，选择蒸汽爆破压强、蒸汽爆破时间、提取超声时间3个因素，采用L9(33)正交试验设计进行试验，优化汽爆条件。

表1 蒸汽爆破提取灵芝子实体粗多糖提取正交试验设计

1.4 数据处理

数据均采用Microcal Origin 8.0软件进行作图，采用SPSS进行分析。

2 结果分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取超声时间对灵芝子实体粗多糖得率的影响

由图1可以看出，随着提取超声时间延长，灵芝子实体中粗多糖得率呈现出先升高后降低趋势，提取超声时间20 min时，灵芝粗多糖得率达到最高值为12.8%。这是因为随着超声时间延长，增大超声波的空化效应，有利于可溶性灵芝粗多糖的溶出，因此灵芝子实体粗多糖的溶出率在增加。超声时间超过20 min时，灵芝子实体粗多糖提取率略有下降，这可能是因为随着超声时间增加，会破坏灵芝子实体中多糖的结构，导致提取率下降[13]。因此，超声时间选择在20 min为宜。

图1 提取超声时间对灵芝子实体粗多糖得率的影响

2.1.2 汽爆保压时间对灵芝子实体粗多糖得率的影响

蒸汽爆破设备的2个参数蒸汽压强和维压时间决定蒸汽爆破的反应强度，影响蒸汽爆破处理物料的结果，进而关系到灵芝粗多糖的得率（图2～图3）。由图2可以看出，在一定范围内，随着蒸汽爆破时间增加，灵芝粗多糖得率不断增加，蒸汽爆破维压时间90 s时，灵芝粗多糖得率达最大值，为10.36%。随后稳压时间延长，灵芝粗多糖得率减小。这可能是因为由于蒸汽爆破过程中，水蒸气随着时间的延长渗透到物料中越多，突然减压时水蒸气的膨胀力充分作用于物料中[14]。但蒸汽爆破时间不是越高越好，随着蒸汽爆破时间的延长使物料中的大分子碳水化合物降解生成甲酸、乙酸等酸类、糠醛、芳香类化合物、脂肪酸类化合物和呋喃化合物，所以灵芝粗多糖得率降低[15]。

图2 汽爆保压时间对灵芝子实体粗多糖得率的影响

2.1.3 蒸汽爆破压强对灵芝子实体粗多糖得率的影响

从图3可以看出，在一定范围内，随着蒸汽爆破压强的增加，灵芝粗多糖得率呈先升后降趋势，蒸汽爆破压强1.2 MPa时，灵芝粗多糖得率达最大值12.18%，随后灵芝粗多糖得率减少。这可能是由于蒸汽压强越大，越能有效打通灵芝子实体内部物质溶出的孔隙，可加速多糖溶出，蒸汽爆破促使物料内部多孔网络的产生和放大，改变多孔性质从而改善萃取过程；另一个原因可能是蒸汽爆破会使灵芝子实体中半纤维素降解，释放出降解产物水溶性多糖，导致灵芝多糖得率提高，易军鹏等[16]的研究证实该结论。随着蒸汽压强变大，使得灵芝粗多糖得率降低。但蒸汽爆破压强继续增加时，灵芝多糖得率会下降，推测是由于巨大的机械剪切力使灵芝子实体中的糖苷键进一步断裂，多糖降解成为寡糖或单糖等[17]。

图3 蒸汽爆破压强对灵芝子实体粗多糖得率的影响

2.2 正交试验结果与分析

根据单因素的试验结果，设计正交试验，试验结果见表2。

根据表2的结果，经极差分析可知，试验因素对灵芝粗多糖得率影响的主次顺序为C＞B＞A，即汽爆压强＞汽爆时间＞提取超声时间。由k值大小可知，优化组合为A1B3C3，即提取超声时间20 min，汽爆时间100 s，汽爆压强1.3 MPa。经验证，在此条件下，灵芝粗多糖的得率为14.21%，是汽爆处理前的灵芝粗多糖得率的1.865倍。

表2 蒸汽爆破正交试验结果

2.3 蒸汽爆破压强对灵芝子实体微观结构的影响

图4为不同蒸汽爆破压强对灵芝子实体微观结构的影响。由图4可知，同对照相比，经蒸汽爆破处理后，灵芝子实体纤维束发生剪切和形变，且纤维表面由原来的光滑平整结构逐渐变为粗糙带有空隙的不规则立体结构，灵芝子实体细胞壁也有一定的破坏。灵芝子实体纤维束变得疏松，易发生断裂和破碎现象，内部物质更容易溶出。灵芝多糖分子本身表面有很多活性基团，具有抗氧化和降血糖的作用等。蒸汽爆破处理后形成的疏松纤维束，使灵芝子实体中的功能成分更容易溶出和释放，同时增加溶剂与物料的接触面积，从而增加提取效率[18]。

图4 蒸汽爆破对灵芝子实体微观结构的影响

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除

DPPH自由基是一种稳定的自由基，遇甲醇溶液显紫色，自由基清除剂能够与DPPH的单电子被配对，在最大吸收波长处颜色变浅，吸光度也会随之变小，DPPH自由基清除率越高表明其抗氧化能力越大[19]。由图5可知，灵芝子实体粗多糖清除DPPH的能力较强，质量浓度0.6 mg/mL时两者的清除率均高于90%，基本完成清除。质量浓度低于0.6 mg/mL时经过汽爆处理的灵芝子实体多糖的DPPH清除能力要优于未经汽爆处理过的样品，未汽爆样品IC50为0.36 mg/mL，经过汽爆处理的样品IC50为0.48 mg/mL，比未经过汽爆样品提高16%，原因可能由于在蒸汽爆破处理的过程中，灵芝子实体的完整结构受到破坏，一部分被包裹的多糖被释放出来，增加多糖的种类和得率，使功能因子成分更好的溶出，从而提高DPPH的清除率[20]。

图5 可溶性灵芝粗多糖对DPPH自由基清除率比较

2.4.2 羟自由基清除率

由图6可知，灵芝多糖羟自由基清除能力都随着质量浓度的增加而增强。对汽爆处理后和未处理的灵芝多糖清除自由基能力的比较，可以看到汽爆处理后，灵芝多糖的羟自由基清除能力明显增强，清除率相比于未处理组显著增加，未经过处理的灵芝多糖羟自由基清除率IC50为0.457 mg/mL，经过汽爆处理的灵芝多糖IC50为0.60 mg/mL，比汽爆处理前提高31%，原因是蒸汽爆破使一部分被包裹的多糖释放出来，增加了多糖的得率和种类，从而提升灵芝多糖的抗氧化活性，但均低于相同浓度的VC。

图6 可溶性灵芝粗多糖对羟自由基清除率比较

2.4.3 还原力测定

由图7可知，无论经过汽爆与否，灵芝子实体多糖均具有一定的还原能力，并随着多糖质量浓度增加而逐渐增大。且在一定浓度范围内，未经汽爆的样品还原能力要优于蒸汽爆破处理过的样品，原因可能是在蒸汽爆破过程中，部分多糖在高温高压作用下，由于糖苷键的断裂，一部分多糖被转化，可能导致还原能力下降[21]。

图7 可溶性灵芝粗多糖总还原能力对比

3 结论

在利用蒸汽爆破处理灵芝子实体粗多糖试验过程中，随着多糖提取超声时间的延长、汽爆维压时间的延长、汽爆压强的增加，灵芝子实体粗多糖的得率和DPPH清除率、羟自由基清除率在一定程度上都有所提高，在还原力的测定中，经过蒸汽爆破的灵芝子实体还原力低于未经汽爆处理的样品。这是因为蒸汽爆破预处理可以打开多糖溶出的通路，使多糖溶出加快，或者高温高压对化学键的破坏，使多糖的种类和得率发生变化。蒸汽爆破预处理使得灵芝子实体总体的粗多糖溶出率得到提升，这使得蒸汽爆破技术预处理灵芝子实体便于制成固体饮片，为产品提供新思路和理论依据，也为灵芝子实体利用提供方法。