甘蓝型油菜-萝卜C染色体附加系与普通白菜杂交F1的SSR标记鉴定

丁云花 Holger Budahn 赵 泓 赵岫云*

（1 北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，蔬菜种质改良北京市重点实验室，北京 100097；2 德国JKI 栽培植物联邦研究中心园艺作物育种研究所，Quedlinburg D-06484）

萝卜（Raphanus）与芸薹（Brassica）是十字花科中两个非常重要的近缘属。早在1924年Karpechenko 就开始进行萝卜和芸薹之间的杂交试验，以创造新的物种或实现基因渐渗（Karpechenko，1924）。迄今，萝卜中已有多个有益基因通过萝卜与芸薹属作物之间的杂交而导入到芸薹属作物中，如细胞质雄性不育基因和细胞核育性恢复基因（Bannerot et al.，1974，1977；Heyn，1976；Budar & Pelletier，2001）、抗TuMV基因（Krämer et al.，2003）、抗甜菜根结线虫基因（Clauss，1978；Peterka et al.，2004）等。在前人研究基础上，Budahn 等（2008）通过萝卜附加系与甘蓝型油菜回交开发了一整套甘蓝型油菜-萝卜附加系，并利用染色体附加系定位了1 个抗甜菜胞囊线虫的QTL 位点（Budahn et al.，2009）。

利用甘蓝型油菜-萝卜附加系与白菜类作物进行回交，可将萝卜染色体导入白菜类作物，创制具有萝卜优异性状的白菜类新种质。而在回交后代中，能否高效选择附加萝卜染色体的目标材料将直接影响新种质创制的效率。利用分子标记技术可以在苗期进行目标基因型的高效选择。本试验利用一套已知萝卜染色体组成的甘蓝型油菜-萝卜附加系标准材料，参考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）构建的萝卜C 染色体锚定标记的连锁图谱，建立能够准确鉴定甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系与普通白菜杂交后代中外源萝卜C 染色体的特异SSR 标记，以期应用于将萝卜C 染色体导入白菜基因组的回交过程中目标材料的高效选择。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试材料均由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。一套包含21 个已知萝卜染色体组成的标准材料，包括萝卜亲本A24/2 和A107/1（两者均含萝卜9 对染色体A～I），甘蓝型油菜亲本A3/1 和A246/1（两者均不含萝卜染色体），一套甘蓝型油菜-萝卜多体附加系14/52（附加萝卜染色体B、D 和G）、14/15-66（附加萝卜染色体A、E 和I）、14/32（附加萝卜染色体C 和F）、14/53（附加萝卜染色体D）、14/35（附加萝卜染色体B、C、F、H和I）、14/37（附加萝卜染色体B 和H）、14/45（附加萝卜染色体B、C、E 和G）、14/15-61（附加萝卜染色体A、E 和I），一整套甘蓝型油菜-萝卜二体附加系AA（含萝卜染色体A）、BB（含萝卜染色体B）、CC（含萝卜染色体C）、DD（含萝卜染色体D）、EE（含萝卜染色体E）、FF（含萝卜染色体F）、GG（含萝卜染色体G）、HH（含萝卜染色体H）、II（含萝卜染色体I）；普通白菜品种559（不含萝卜染色体C）、甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 与普通白菜559 杂交获得的F1。

2017 年9 月15 日在北京市农林科学院蔬菜研究中心农场日光温室种植所有材料，分别播种于50 孔穴盘，每穴1 粒；F1播种10 穴，其余材料均播种5 穴。出苗30 d 后取完全展开的心叶用于提取DNA。

1.2 试验方法

DNA 提取采用SDS 法（李丽和郑晓鹰，2003），浓度调整至8 ng·μL-1。

萝卜染色体C 的SSR 引物：参考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）构建的萝卜染色体定位连锁图谱，选择定位于萝卜C 染色体连锁群的2 条SSR 标记引物，引物序列见表1。

表1 SSR 引物序列

PCR反应体系（6 μL）：10× Buffer 0.6 μL，MgCl2（50 mmol·L-1）0.3 μL，dNTPs（12.5 mmol ·L-1）0.12 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.12 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，DNA（8 ng ·μL-1）1.6 μL，ddH2O 2.66 μL。PCR 扩增程序：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸7 min；10℃保存。PCR 扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳在自动测序仪LI-COR 4300 上分离检测。

荧光原位杂交鉴定：利用萝卜基因组特异探针pURsN 检测甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 与普通白菜559 杂交F1的遗传背景中是否含有萝卜基因组。其中，萝卜基因组特异探针pURsN的制备参考Hirai 等（1995）的方法，酶解和制片参考赵泓等（2014）的方法，荧光原位杂交参考Schrader 等（2000）的方法。

2 结果与分析

2.1 外源萝卜C 染色体SSR 标记的建立

根据21 个甘蓝型油菜-萝卜附加系标准材料已知所含染色体的情况，可列出各标准材料中所含萝卜C 染色体的信息（表2）。

利用2对SSR引物RsSA078 和RH148分别对21 个甘蓝型油菜-萝卜附加系标准材料的DNA进行PCR 扩增。从图1 可以看出，RsSA078 和RH148 的扩增结果一致，均在A24/2、A107/1、14/32、14/35、14/45 和CC 中扩增出了特异片段，片段大小分别为170 bp 和190 bp，而其他15 份材料没有扩增出相应条带。该结果与表2 所列的21 个甘蓝型油菜-萝卜附加系标准材料所含萝卜C 染色体的信息一致，说明这2 个SSR 引物标记RsSA078-170 和RH148-190 均为萝卜C 染色体的特异标记。

图1 引物RsSA078 和RH148 对21 个甘蓝型油菜-萝卜附加系标准材料的SSR 扩增结果

表2 21 个甘蓝型油菜-萝卜附加系标准材料中萝卜C 染色体的信息

2.2 利用SSR 特异标记鉴定F1 外源萝卜C 染色体

利用上述建立的萝卜C 染色体的SSR 特异标记RsSA078-170 和RH148-190 对甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC、普通白菜559 及其杂交F1进行外源萝卜C 染色体的鉴定与筛选。从图2 可以看出，2 对SSR 引物RsSA078 和RH148 的PCR 扩增结果一致，甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 的4 个单株和10 个F1单株均扩增出大小为170 bp 和190 bp 的特异片段，而普通白菜559 没有扩增出相应的特异片段。说明甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 与普通白菜559 杂交后10 个F1单株均含有萝卜C 染色体。

图2 F1 外源萝卜C 染色体的SSR 特异标记鉴定结果

2.3 利用荧光原位杂交技术检测F1 萝卜基因组

利用萝卜基因组特异探针pURsN 分别与亲本甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC、普通白菜559 及其杂交F1的基因组进行荧光原位杂交鉴定。结果显示（图3），甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 和F1有绿色杂交信号，而普通白菜559 没有杂交信号，说明甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 和F1含有萝卜基因组，普通白菜559 不含萝卜基因组。

图3 萝卜基因组特异探针pURsN 对F1 基因组的荧光原位杂交检测结果

3 结论与讨论

对于属（种）间杂种的鉴定，除了传统的形态学、细胞学和同工酶方法之外，还有现代分子标记和原位杂交等方法。利用传统形态学和细胞学方法虽然也能对目标材料进行选择，但是选择效率低，尤其是对数量性状或更复杂的多性状选择，其选择效率和准确率就更低了。现代分子生物技术的快速发展，为复杂的多性状在DNA 水平进行早期、准确、高效地选择提供了可能。SSR 分子标记是以1～6 个核苷酸为基本单位的串联重复序列，广泛存在于基因组中，为共显性遗传，重复性好，被广泛应用于遗传连锁图谱的构建、分子标记辅助选择、作物遗传多样性的研究、基因挖掘、品种纯度鉴定等植物种质资源和育种领域（张增翠和侯喜林，2004；Iniguez-Luy et al.，2008；顾爱侠 等，2009；巩红影 等，2014；王娟 等，2017；赖瑞强 等，2018；张润霖 等，2020；朱志成，2021）。

本试验参考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）构建的萝卜C 染色体锚定标记的连锁图谱，利用21 个已知萝卜染色体组成的标准材料确定了2 个甘蓝型油菜-萝卜附加系中外源萝卜C染色体的特异SSR 标记RsSA078-170 和RH148-190。应用这2 个标记对甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 与普通白菜559 杂交所得的F1进行外源萝卜C 染色体鉴定，结果表明10 个F1单株均附加了萝卜C 染色体，说明通过杂交可以将萝卜C 染色体从甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系CC 导入普通白菜中。同时，利用萝卜基因组特异探针pURsN 对F1的基因组进行荧光原位杂交检测，结果表明F1含有萝卜基因组，该结果验证了2个SSR 标记RsSA078-170 和RH148-190 的鉴定结果是准确的。说明SSR 特异标记RsSA078-170 和RH148-190 可以用于甘蓝型油菜-萝卜C 染色体附加系与普通白菜559 杂交后代中外源萝卜C 染色体的鉴定。