蒲公英花提取物对红细胞氧化损伤的抑制作用

李 波，信 瑞，柳承鑫，曲丹华

(1.吉林大学第二医院 放射线科,吉林 长春130041；2.吉林大学第二医院 呼吸与危重症医学科，吉林 长春130041)

细胞通过有氧代谢使生命活动得以进行和维持,有氧代谢过程中会产生活性氧(ROS)等多种自由基[1]。自由基对细胞来说是一把双刃剑，一方面,自由基是有氧代谢所必备的；另一方面,对机体存在毒性。许多实验已经表明,自由基反应能导致细胞退化、老化、裂解[2]。H2O2是一种 ROS，在诱导细胞的损伤、死亡中起关键作用。它能损伤DNA、使酶失活、氧化激素、破坏细胞膜的完整性,甚至杀死细胞等，是多种疾病的起点[3]。红细胞富含脂类及铁,其中Fe2+是自由基反应的催化剂，循环中的红细胞经常接触高分压的氧,因此,红细胞易受到自由基的损伤[4]。正常情况下，红细胞能维持氧化与抗氧化状态的平衡。如果红细胞过氧化时，就会受到损伤,使正常红细胞的衰老，破坏[5]。

经科学证实，蒲公英具有抗氧化活性、延缓衰老、消炎止痛等作用，其消炎机理之一是具有抗氧化活性，蒲公英中含有很多抗氧化成分，蒲公英和玉米须、茵陈蒿水煎液都有抗自由基的作用。此外，其所含的绿原酸也有抗氧化作用。许多资料显示，蒲公英总黄酮提取液也可以增强机体内源性抗衰老物质活性，对于延缓机体衰老具有重要意义。

蒲公英始载于《唐本草》，《图经本草》作仆公罂，《本草纲目》作地丁。为菊科植物蒲公英，或同属数种植物的干燥全草。味苦、甘，性寒[6]。经研究发现，蒲公英花主要化学成分有黄酮、酚酸、多糖、萜类、半倍萜内酯、香豆素等多种功能成分。具清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效。用于疔疮肿毒、乳痈、瘰疬、目赤、咽痛、肺痈、肠痈、湿热黄疸、热淋涩痛[7]。因此，本课题以药食两用性植物蒲公英花乙醇提取物(Alcohol Extract of Dandelion Flowers,AEDF)作为受试药物，以红细胞自氧化溶血和自由基(H2O2)诱导所致氧化溶血为研究模型，通过对受试药物在不同浓度下的吸光度的测定，并计算其溶血度，探讨蒲公英花的抗氧化作用，并对其抗氧化活性成分进行定性分析，以期开发新的天然植物氧化防护剂。

1 材料与方法

1.1药物置备野生蒲公英花，自然荫干后粉碎，水煮醇沉、大孔树脂吸附等处理后得到蒲公英花乙醇提取物(AEDF)。

1.2 主要仪器、试剂XSS250(FZ)型深部X线治疗机，温州大华仪器仪表有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；LD5-100型离心机，北京医用离心机厂；循环水式真空泵，上海亚荣生化仪器厂；722型光栅分光光度计，北京中翰仪器有限公司；肝素钠，长春市化学试剂厂；苯胺-邻苯二甲酸，长春市化学试剂厂。

1.3 AEDF提取物溶液的配制用PBS 配置不同浓度的AEDF溶液，浓度分别为12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL各20 ml，4℃冰箱保存，备用。

1.4 AEDF定性分析实验按照植物化学预试方法，分别用2% AlCl3、苯胺-邻苯二甲酸等与提取物中成分反应，检视颜色的变化。泡沫试验，观察泡沫消退的时间。同时对提取物进行硅胶薄层层析(TLC)，依据TLC斑点所呈颜色推断化合物类别：黄酮类化合物(硅胶G，展开剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶水=4∶1∶5，2 % AlCl3显色)；多糖(硅胶G，展开剂为乙酸乙酯∶吡啶∶无水乙醇∶水=82∶1∶2，苯胺-邻苯二甲酸显色)。

1.5 1%人红细胞悬液的制备健康成人静脉血4 ml，肝素抗凝。用pH=7.4的PBS冲洗，1 500 r/min，离心10 min。用PBS配制1%红细胞悬液，4℃冰箱保存，备用。

1.6 实验方法

1.6.1人红细胞溶血度的测定 取1%人红细胞悬液，加入预先配置好的5种浓度的AEDF溶液中，恒温水浴箱孵育24 h，分别以H2O2诱导作为损伤因素，用722型紫外-可见分光光度计测定红细胞氧化损伤的溶血度。探讨AEDF对体外红细胞氧化损伤的抑制作用。

1.6.2人红细胞自氧化溶血度的测定 自氧化对照组：分别加入PBS 200 μl、3 ml浓度为1%的红细胞悬液；实验组：200 μl PBS配制的含有不同浓度的AEDF再向其加入3 ml浓度为1 % 的人红细胞悬液。充分混匀，将对照组和各实验组同时置于37℃恒温水浴孵育24 h，1 500 r/min，离心10 min。722型紫外-可见分光光度计，于470 nm波长处测定吸光度，将对照组规定为100%溶血，计算溶血度。实验组每个浓度设3个平行试管且重复3次。

溶血度=实验组吸光度/自氧化对照组吸光度× 100%

1.6.3自由基(H2O2)诱导所致红细胞溶血度的测定 空白组：分别加入230 μl PBS、3 ml浓度为1%的红细胞悬液；对照组：分别加入200 μl PBS、30 μl浓度为 30%的H2O2溶液、3 ml浓度为1%的红细胞悬液；实验组：取200 μl PBS配制的含有不同浓度的AEDF，再向其加入30 μl浓度为30%的H2O2、3 ml浓度为1%的人红细胞悬液。充分混匀，将空白组、对照组、各实验组试管同时置于37℃恒温水浴1 h，1 500 r/min，离心10 min。722型光栅分光光度计，470 nm波长处测定吸光度，视对照组为100%溶血，计算各组溶血度。实验组每个浓度设3个平行试管且重复3次。

溶血度=(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100%

2 结果

2.1 AEDF化学成分定性分析结果

采用化学预示法和薄层层析法测定AEDF的主要化学成分。结果显示，AlCl3显黄色斑点，置紫外灯下，出现明显黄绿色荧光，TLC出现明显黄绿色斑点，说明含黄酮类化合物；将苯胺-邻苯二甲酸加入提取液中反应生成蓝色，TLC显蓝色斑点，说明多糖物质的存在。

2.2 人红细胞溶血度测定的结果

2.2.1人红细胞自氧化溶血度测定的结果 经37℃恒温水浴孵育24 h后，自氧化对照组和各实验组均出现了不同程度的溶血现象，AEDF各剂量组红细胞溶血度显著低于氧化对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。尚可认为AEDF对红细胞自氧化溶血有明显的抑制作用，且随着剂量的增加，红细胞溶血度逐渐降低，提示AEDF与红细胞自氧化溶血度可能存在一定的剂量-反应关系，见表1，图1。

表1 AEDF对红细胞氧化溶血的影响

图1 AEDF对红细胞的氧化溶血的影响

2.2.2自由基(H2O2)所致人红细胞溶血度的测定结果 经自由基(H2O2)诱导、37 ℃恒温水浴1 h后，空白组、对照组、各实验组红细胞有不同程度的溶血现象且显著，与对照组进行比较，AEDF各剂量组红细胞溶血度显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，可以认为ADEF对H2O2所致红细胞溶血有明显的抑制作用,且随着剂量的增加，红细胞溶血度逐渐降低，提示AEDF与自由基(H2O2)所致红细胞的溶血度可能存在一定的剂量-反应关系，见表2、图2。

表2 AEDF对氢过氧化引起的红细胞溶血的影响

3 讨论

红细胞在血液循环中至关重要，维持红细胞正常生物功能须依赖红细胞膜的完整和弹性。一旦膜发生缺失或脆性增加，红细胞就可能破裂，形成溶血。而红细胞膜在自由基介导下的氧化被认为是造成红细胞损伤的重要原因[8]。红细胞由于富含不饱和脂肪酸和Fe2+而极易受到氧化性损伤，细胞中的氧自由基会攻击膜磷脂层会诱发链式反应,发生脂质过氧化，膜脆性增，细胞肿胀、破裂，发生溶血[9]。H2O2可与血红素辅基中的Fe2+发生Fenton型反应,产生极强的氧化剂羟自由基，从而加速细胞膜脂质过氧化，导致红细胞氧化溶血[10]。

图2 AEDF对氢过氧化引起的红细胞溶血的的影响

氧化应激[11]，ROS 十分活泼，如超氧阴离子能够发生歧化反应、还原反应、氧化反应和质子化反应；H2O2则能够生成羟自由基和参与氧化反应等。通过这些反应，再生成一些更活泼、寿命更长、危害更大的过氧化物如脂质过氧化物等，进一步造成对细胞的损伤[12]。H2O2是体内代谢产生的一种活性氧，在诱导神经元细胞的损伤乃至死亡中起了关键作用[13-14]。H2O2易穿透细胞膜，与细胞内的还原型铁离子通过 Fenton 反应，生成高度毒性的羟自由基，可以对多种细胞造成毒性，特别是红细胞，因其H2O2酶活性低，故比其他部位更易受到氧化损伤[15]。本研究选用红细胞自氧化溶血和自由基(H2O2)所致氧化溶血为研究模型，用于研究AEDF的氧化作用效果。有实验表明：自由基可使细胞膜、线粒体膜脂质过氧化及 DNA 损伤[16]。

抗氧化剂是一类能够清除机体所产生的过量活性氧并能够防止机体遭受氧化损伤，对机体具有保护作用的物质。目前全世界己经发现了许多对氧化应激具有防治作用的化学物质和生物制剂，黄酮类、含氮化合物、植酸、类等[17]。经研究发现蒲公英花中多糖类平均含量为4.09%，黄酮类平均含量为3.65%[18]，且对许多细胞有抗氧化作用。