两例云南少数民族罕见FUT1基因位点突变致类孟买血型血清学与分子特征分析

罗梓瑜 李春伟 董伟群

类孟买血型属于H血型系统，H抗原缺乏表现型是指红细胞上完全或部分缺乏H抗原的稀有表现型。其中，H缺乏的非分泌型被称为孟买型，其个体红细胞和分泌液中均检测不到ABH抗原，而H缺乏和H部分缺乏的分泌型被称为类孟买型，红细胞表面缺乏ABH抗原，而在唾液等分泌液中却可以找到ABH血型物质。类孟买型在中国人群中鲜有报道，有资料表明中国台湾类孟买血型的比例大约在1/8 000～1/10 000，中国香港约1/15 620[1，2]。在1994年首次报道了3个无效的FUT1等位基因[5]，随后针对类孟买血型的FUT1（H）和FUT2（Se）基因型的研究报道逐渐深入。迄今为止，世界上大约报道了有60多种FUT1基因突变类型[6]。云南省地处少数民族大杂居的自然地理位置，并且由于本族内通婚现象普遍，因此对于少数民族血型相关基因多态性的研究是保障本地区输血安全的一项重要任务。我们对2019～2020年本院收集到的2例类孟买血型标本进行了较全面研究。

材料与方法

1 研究对象 患者1：云南少数民族地区傈僳族女姓，28岁，G3P0，现孕39+2W，在县级医院产检时发现血型鉴定正反定型不符，患者否认手术史、输血史，遂转至我院就诊。患者2：云南少数民族地区傈僳族女性，30岁，常规体检发现血型鉴定正反定型不符，否认手术史、输血史。分别取外周静脉血进行实验。均签署知情同意书。

2 试剂仪器 抗-A、抗-B、抗-H（上海血液）；抗-Lea和抗-Leb（Sanquin）；ABO标准红细胞、抗筛细胞（上海血液）；谱细胞（Sanquin）；核酸提取试剂盒、人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒、FUT1.2外显子测序试剂盒（江苏中济万泰）；人源抗-A、抗-B（本室自制，效价不低于128，且不含冷凝集素和不规则抗体），所有试剂均在效期内使用。血清学专用离心机（日本久保田，KA-2200）。

3 血型血清学实验（1）试管法鉴定ABO 及Lewis血型，反定型加自身对照。（2）采用试管法进行抗体筛选和抗体鉴定实验。（3）与抗-H反应。（4）进行患者红细胞的吸收放散试验。

4 基因组DNA提取 按照江苏中济万泰核酸提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA，调整其浓度为50 ng/μL，纯度A260/A280在1.7～1.8之间的DNA标本进行检测。

5 ABO血型基因分型 采用江苏中济万泰生物公司人红细胞ABO血型基因分型试剂盒（荧光PCR法）进行检测，实验操作步骤和结果判断标准按照试剂盒说明书进行，检测位点包括A，A205，B，O（261G缺失），O1，O2等位基因。

6FUT1、FUT2基因测序 采用江苏中济万泰生物公司FUT1、2外显子测序试剂盒进行检测。对FUT1基因第4外显子和FUT2基因第2外显子进行扩增，PCR反应体系如下：加入配置好的PCR工作液35 μL与样本DNA 3.5 μL（浓度50 ng/μL）混合，漩涡混匀工作液-DNA混合液，800 r/min瞬时离心10秒，使馆壁残留液体聚于管底。剪切前期稀释后的引物反应管，分别向每个引物管中各加入35 μL的上述混合液，盖上反应管的盖子。将反应管漩涡混匀，反应管板式离心7 500 r/min 1分钟。PCR扩增条件为：96℃ 2 min，1 cycle;96℃ 20 s/68℃ 60 s，5 cycle;96℃ 20s/65℃ 50 s/72℃45 s，10 cycle;96℃ 20 s/62℃ 50 s/72℃ 1 min，22 cycle;72℃ 2 min，1 cycle，反应体积设定为40 μL。PCR产物经胶回收纯化后进行Sanger测序，测序引物同扩增引物。用Chromas软件阅读测序图谱，使用DAN-MAN5.22软件将测定所得序列与GENEBANK序号为M35531（FUT1）、U17894（FUT2）的标准序列做比对分析。

结 果

1 血型血清学试验结果（1）ABO、Lewis血型鉴定与抗-H反应结果见表1。（2）试管法抗体筛选实验均为阳性，凝集程度无差异。（3）试管法抗体鉴定实验，血清与谱细胞反应均为阳性且凝集强度无差异，疑为某种高频抗原抗体。（4）红细胞吸收放散试验，放散液与B细胞均呈1+阳性反应，表明两名患者红细胞表面均存在较弱的B抗原。根据血清学实验结果，两样本疑为Bmh血型。见表1、表2。

表1 2例类孟买血型的血清学及分子生物学研究结果

表2 抗体鉴定实验结果

2 ABO 基因分型结果1号患者和2号患者的ABO基因型一致，均为B/B，结果见图1。

图1 ABO基因分型结果

3FUT1和FUT2基因测序结果FUT1基因直接测序结果表明，患者①和患者②的FUT1基因均携带c.803G＞A纯合突变（图2）。两例患者的FUT2基因均同时携带c.357C＞A和c.385A＞T纯合突变（图3）。

图2 FUT1基因测序结果

图3 FUT2基因测序结果

讨 论

1952年BHENDE在印度孟买首先发现孟买型，后来LEVINE又在1961年发现类孟买型，孟买型和类孟买型是均为罕见的红细胞血型，属于非常重要的Hh血型系统，该系统只有一个H抗原。H抗原的合成是由α（1，2）岩藻糖基转移酶催化，由GDP-L-半乳糖提供糖基到前体分子末端半乳糖基的C-2位上形成。H抗原在红细胞上的表达受控于FUT1基因，该基因共有4个外显子但只有第4外显子具有编码功能，故进行分子生物学检测时，通常只检测第4外显子。H抗原缺乏表现型的形成机制是FUT1基因突变导致α1，2-L-岩藻糖基转移酶失去活性，无法催化L-岩藻糖连接到前体糖链上形成H抗原[6]。FUT1座位上的隐性基因h有很多种类型，最常见的是：c.551_552delAG、c.881_882delTT、c.658 C＞T等[1，2]。多数H缺失型红细胞为某一种突变的纯合子，也有一些为两种不同突变的杂合状态[8]。在郭忠慧[8]等报道的10例类孟买血型个体中就发现h1h1、h2h2以及h3h3纯合的个体，也有h1h2这类杂合个体的出现。

H抗原的合成受FUT1和FUT2两个同源性较高的基因控制，两个结构基因都位于19号染色体，是紧密连锁的两个位点。两个基因都编码α（1，2）岩藻糖基转移酶，只是编码的糖基转移酶分别作用于不同的底物，最终使得FUT1基因决定红细胞膜上H抗原的表达，而FUT2作为分泌基因，决定了分泌物中是否存在ABH血型物质，并且在红系中不表达，主要在唾液腺和泌尿生殖组织中表达[8，10]。FUT2（SE）基因包含2个外显子，所有的蛋白编码序列都在第2外显子[11]，因此FUT2基因第2外显子的分子生物学研究是分析类孟买型个体分泌状态的关键部分。

在血清学实验的基础上，通过对FUT1和FUT2基因的分子生物学研究，就能对孟买型和类孟买型的有较为明确的结论。本文报道的两个病例，来自同一地区的同一少数民族，两例患者无明确亲缘关系但却存在相同的FUT1和FUT2基因位点的突变，其中FUT1基因c.803G＞A纯合突变，导致第268位氨基酸由半胱氨酸（Cys）变为酪氨酸（Tyr），该突变导致α1，2-L-岩藻糖基转移酶活性改变，进而造成H抗原无法正常合成。在血清学水平，仅能通过吸收放散实验来检测红细胞表面微弱的抗原表达，但在基因分型时可检测出正常的B基因，该现象符合类孟买血型特征。此外，由于收集的样本例数较少，尚不能明确c.803G>A是否为该地区少数民族常见突变类型。今后将进一步加大对该地区少数民族样本的采集检测，以了解该地区H抗原缺乏型血型频率以及突变类型。

对FUT2（SE）的研究显示，两例傈僳族患者都具c.357C＞T同义突变。在苏宇清等[13]的报道中所有被研究的41例中国汉族人群均携带c.357C＞T同义突变，说明c.357C＞T可能是中国人常见的点突变。此次在傈僳族病例中同样被检出，这可作为中国多民族FUT2基因主要流行基因型研究资料之一。c.385A＞T是一个弱的分泌型基因，该位点的错义突变导致p.Ile129Phe。本文中的两例患者同时具有c.357C＞T和c.385A>T的Se等位基因突变类型被称为Sew。有研究表明，这种弱的分泌型等位基因Sew是形成Le（a+b+）的原因[8]，这点与Lewis血型血清学试验结果一致。并且这种弱分泌状态的基因型，在蒙古族中报道比例高达25%[12]，这种等位基因Sew在少数民族人群中如此高比例的报道，为中国少数民族H血型基因多态性的研究奠定了基础。

本研究因条件限制，未能收集先证者的唾液的进行唾液凝集抑制实验，检测唾液中的ABH物质，以此来对其分泌状态进行更全面的了解。此外对两者家系资料的收集正在积极进行中，对先证者家庭成员相关基因的研究，有助于更全面的了解该地区傈僳族FUT1和FUT2基因的分子基础、遗传异质性和基因多态性，以及进一步对FUT1和FUT2基因在少数民族中的连锁遗传关系进行全面的研究。

与孟买型不同的是，类孟买血型的个体属于分泌型的个体，因此血清和分泌液中均存在血型物质，其血清中通常存在不规则抗体，因此类孟买血型的个体在需要输血时，应当首选自体输血或同型H抗原缺乏的血液。在自体输血困难和找不到同型血液时，可谨慎选择37度时与患者血清无反应或反应最弱的ABO同型血液输注[15]。

有报道显示，类孟买血型在不同种族、地域、人群中的分布以及遗传具有不同的特点。云南拉祜族人群中类孟买血型个体频率可达1.88%[14]，关于傈僳族类孟买个体的研究未见相关报道，对傈僳族人群类孟买血型进行更进一步的系统性研究，可以对云南少数民族类孟买血型的分布情况以及分子生物学特征有更全面的了解，为云南这个多民族聚集地区的输血安全工作的开展提供理论基础，在少数民族血型相关基因的多态性研究过程中具有重要的意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突