碳青霉烯酶耐药肺炎克雷伯菌耐药基因分布及与表型相关性分析

谢强 谢瑞玉 徐添天

随着抗菌药物的大量及不合理使用，多重耐药和泛耐药菌在临床上不断出现，严重威胁人类健康。耐碳青霉烯酶类抗菌药物的肠杆菌目细菌，特别是耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌（CRKP）危害尤为严重[1]，全国细菌耐药监测网的数据显示，亚胺培南耐药率从2014年的4.8%升至2019年的10.5%[2]。由于CRKP的高传播力和高耐药率以及CRKP感染者的高死亡率，CRKP引起临床广泛关注[3，4]。近年来，我院肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈上升趋势[5]。因此，研究我院CRKP的耐药机制，对遏制我院CRKP的流行和传播有重要意义。本研究以全基因组测序技术全面研究本院分离的CRKP的耐药基因分布，探讨其与耐药表型的相关性，现报道如下：

材料与方法

1 菌株来源 收集我院2020年1月～2020年11月分离的临床非重复CRKP 28株。其中26株来自呼吸道标本，2株来自血液标本。

2 主要仪器与试剂 全自动微生物鉴定仪VITEK-2 Compact及AST-N334药敏卡购自法国梅里埃公司；Heal Force A2型生物安全柜购自力康国际贸易（上海）有限公司；SHP-400E型智能生化培养箱购自上海三发科学仪器有限公司；台式高速离心机、微量移液器购自德国Eppendorf公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生华科技（北京）有限公司；血平板、麦康凯平板和MH平板均购自郑州安图有限公司；药敏纸片购自英国Oxoid公司。

3 细菌鉴定和药敏试验 采用VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统，部分药物补充试验采用纸片扩散法（K-B法），具体标准参照CLIS 2019[6]推荐的方法。

4 全基因序列测定 用天根生华科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测细菌基因组。将所提基因组DNA送至北京诺和致源科技股份有限公司测序，高通量测序（Illumina NovaSeq PE150测序平台）得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），即Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。对测序数据进行过滤处理，去除包含Adapter的序列及低质量数据，得到的Clean Data用于后续分析。

5 耐药基因分析 使用CARD数据库（Comprehensive Antibiotic Research Database），该数据库是近年来最受关注的抗性基因数据库，它具有信息全面，对用户友好，更新维护及时等优势。该数据库的核心构成是Antibiotic Resistance Ontolog（ARO），它整合了序列、抗生素抗性、作用机制、ARO之间的关联等信息，通过该数据库的注释，可以找到耐药性相关基因的名称，所耐药的抗生素种类等信息。使用CARD数据库提供的Resistance Gene Identifier（RGI）软件将目标物种的氨基酸序列与CARD数据库进行比对（RGI内置blastp，默认evalue≤1e-30），根据RGI的比对结果，统计注释到数据库的抗性基因信息，最终得到28株CRKP携带的所有耐药基因。

6 耐药表型与耐药基因型的符合率 根据药物敏感试验的耐药表型与WGS检测筛查出的耐药基因型一致者，定义为两者符合；否则，均视为不符合。

结 果

1 28株CRKP耐药基因检测结果 28株CRKP经全基因组测序检测，共发现47种耐药基因。28株CRKP均携带1种碳青霉烯类耐药基因，其中25株携带blaKPC-2基因，2株携带blaNDM-5基因，1株携带blaOXA-48基因；28株CRKP均携带ESBLs耐药基因，其中以blaTEM-1和blaCTX-M-15最多，分别检出25株和21株；氨基糖苷类耐药基因中，AAC（6'）-Ib-cr和AAC（3）-IIa检出最多，分别检出20株和19株，其中18株同时携带两者；喹诺酮类耐药基因中，oqxA和AAC（6'）-Ib-cr检出最多，分别检出24株和20株，其中20株同时携带两者；28株CRKP均检出磷霉素耐药基因FosA6；磺胺类耐药基因有3种，其中sul2有6株CRKP携带。28株CRKP除均携带碳青霉烯类耐药基因外，还同时携带不同型别的ESBLs耐药基因、磷霉素耐药基因FosA6。其中，27株（96.43%）还同时携带氨基糖苷类耐药基因和喹诺酮类耐药基因。具体的耐药基因检出情况见表1，部分菌株DNA序列组装结果的Scaffold文件见图1。

图1 部分菌株DNA序列组装结果的Scaffold文件

表1 28株CRKP携带常见的耐药基因型

2 耐药表型与耐药基因型符合率 28株CRKP的耐药表型与耐药基因型符合率结果：碳青霉烯类、头孢菌素和阿米卡星的符合率均为100%，喹诺酮类和庆大霉素的符合率均为96.43%，磺胺类的符合率为87.50%。具体见表2。

表2 28株CRKP耐药基因与耐药表型符合率的比较

讨 论

本研究分离的CRKP主要来自于呼吸道标本，占92.86%，提示呼吸道感染应为CRKP感染的防控重点[7]。且28株CRKP对碳青霉烯类、头孢菌素类、β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂合剂的耐药率为100%，对阿米卡星的耐药率14.29%，未检出替加环素耐药株。产生碳青霉烯酶是CRKP对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制[8，9]。通过全基因测序结果显示，28株CRKP中25株产blaKPC-2酶，2株产blaNMD-5酶，1株产blaOXA-48酶，这与王方等研究相似[10]。本研究检出的β-内酰胺酶较多，主要有blaKPC-2、blaNDM-5、blaOXA-48、blaOXA-33、blaCTX-M-15、blaSHV-28、blaTEM-1，其中blaSHV（blaSHV-11、blaSHV-27和blaSHV-28）和blaCTX-M（blaCTX-M-15、blaCTX-M-99 和blaCTX-M-3）的检出率分别为100%和92.86%，高于杨燕文等报道[11]。磺胺类的耐药基因（sul1、sul2和sul3）检出率为25.00%，低于有关研究[12]，甲氧苄氨嘧啶耐药基因（dfrA14和dfrA12）的检出率为21.43%，这与复方新诺明的药敏结果不一致，可能存在其他耐药基因，比如整合子介导的耐药等；27株CRKP检出喹诺酮类耐药基因，低于左氧氟沙星的药敏（耐药率100%）结果，可能与其他抗菌药物的耐药基因的高表达起协同耐药的作用或者是固有基因的突变引起；检出众多氨基糖苷类耐药基因，由测序结果可以看出，rmtB基因可能是阿米卡星的主要耐药基因，因为4株耐药株中均检出了rmtB基因。国内外研究显示[13，14]，磷霉素是目前多重耐药细菌治疗常用药物。据文献报道，产ESBLs的大肠埃希菌对磷霉素的敏感率高达86%～100%[15]。ANDREA ENDIMIANI等[16]的研究结果显示，68株携带有blaKPC耐药基因的肺炎克雷伯菌，其中包括23株对替加环素和/或多粘菌素不敏感的菌株，对磷霉素的敏感率为87%～93%。本研究中，未对磷霉素进行药敏实验，但从全基因测序的结果中发现，28株CRKP均携带磷霉素耐药基因FosA6，磷霉素对本院CRKP感染的治疗可能均无效，这与丁月平等[17]的研究结果相同。本研究未检出四环素类抗菌药物的耐药基因，药敏结果显示，1株CRKP对替加环素中介，目前替加环素的耐药机制主要为外排泵机制[18]，该株替加环素不敏感株可能存在其他耐药机制。所有CRKP均未检出多粘菌素的耐药基因，目前认为多黏菌素联合碳青霉烯类抗菌药物或其他抗菌药物是治疗CRKP感染的有效方案。

28株CRKP的耐药表型和耐药基因在β-内酰胺类和阿米卡星的符合率均为100%。因此，通过对菌株的基因型检测，能够很好的预测细菌的耐药表型，对指导临床抗菌药物的选择有很大的帮助。

综上所述，我院的CRKP耐药严重，同时携带多种的耐药基因，呈现泛耐药表型，应加强细菌耐药性监测，同时制定严格的院感防控措施，防止其在医院内的传播和流行。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突