血清Gd-IgA1水平与IgA肾病患者临床及病理特点的关系分析*

肖勇 贺海东 胡屏 孙蔚倩 徐旭东 唐余燕

IgA肾病（IgAN）是全球范围内也是国内最常见的原发性肾小球肾炎，约占肾活检患者的30%～45%，病理特征主要是肾小球系膜区以IgA为主的免疫复合物沉积，其临床表现多样，主要表现为镜下血尿，可伴有不同程度的蛋白尿、水肿等症状。由于IgAN发病原因不清，基础机制未明，目前临床尚缺乏统一的治疗方法。临床医师通常将尿蛋白含量作为指导IgAN治疗及预后判断的重要指标，大量蛋白尿（＞1 g/L）提示肾脏病理损伤严重，肾功能衰退进展较快，需要积极干预。但是对于轻度蛋白尿（＜1 g/d）的IgAN患者的治疗与预后，缺乏统一标准，尤其是在激素使用方面存有争议[1-4]。尽管肾穿刺是目前IgAN诊断及判断预后的最佳方法，但考虑其有创性及风险性，不宜反复进行，所以亟待寻找能反映IgAN病情的指标。本项目组近年来一直致力于少量蛋白尿（＜1 g/d）IgAN患者的治疗与预后研究，前期临床研究发现有一部分少量蛋白尿IgAN患者的肾脏病理改变较重，将这部分患者分为两组，一组给予激素及常规ACEI/ARB联合治疗，作为实验组，一组仅给予激素及常规血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体抑制剂（ACEI/ARB）治疗作为对照组，随访3年，结果发现与对照组相比，治疗组尿蛋白量显著减少；中等量蛋白尿、肾小球滤过率（eGFR）下降的终点事件发生率显著降低[5-7]。该临床研究结果显示，通过临床蛋白尿量来指导IgAN的治疗及预后存在缺陷，一部分少量蛋白尿患者肾脏病理损伤严重，肾功能衰退进展较快，错失治疗时机，导致终末期肾病，给家庭及社会造成巨大负担。因此，寻找能反映IgAN病变程度和预后的无创性生物标志物具有重要临床意义。

近年来的大量研究表明异常糖基化的多聚IgA1（Gd-IgA1）被称为“致肾病IgA”，是IgAN的关键致病因子[8，9]，而目前对于Gd-IgA1与IgAN患者临床及病理特点的研究较少，其能否反映IgAN的病情目前尚不清楚。因此本研究旨在探讨血清Gd-IgA1水平与IgAN患者临床病理特点及激素治疗后反应的关系，为临床指导IgAN的诊断与治疗提供新的思路。

对象与方法

1 对象 前瞻性收集2018年1月～2018年12月本科室住院的慢性肾炎及肾病综合征患者血清，保存于–80℃以备后续实验。实验分成三组，以肾活检证实为IgAN并同意使用激素治疗的患者作为实验组（40例），以肾活检证实为膜性肾病患者作为疾病对照组（20例），以我院体检中心健康体检者作为空白对照组（20例），入选标准：年龄≥18岁，既往未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或肾移植治疗，排除合并感染、肿瘤、妊娠等情况；eGFR均≥50 mL•min-1•（1.73m2）-1。所有标本均已获得受试者知情同意，并得到闵行区中心医院伦理委员会的批准。批件号：2018-010-01K。收集上述三组外周血5 mL，离心并收集血清，同时收集IgAN激素治疗1个月后的血清，利用KM55 ELISA试剂盒检测上述血清样本中Gd-IgA1水平，收集临床生化指标资料，统计分析Gd-IgA1与24 h尿蛋白定量的相关性，并对上述IgAN患者的肾活检病理切片进行Haas分级，对分级结果与Gd-IgA1水平进行统计学分析。

2 方法

2.1 主要试剂：患者肾功能、24 h尿蛋白定量、IgA水平为患者住院期间本院检验科检测，同时使用人半乳糖缺乏IgA1（Gd-IgA1）特异性抗体KM55酶联免疫（ELISA）检测试剂盒检测血清Gd-IgA1，购自日本IBL公司，批号1L-803，货号27600。

2.2 收集标本：所有患者活检当日清晨空腹采血5 mL，即时分离血清，吸入1.5 mL EP管，分装为3小管，贴好标签，放入–80℃冰箱保存备用。登记患者信息，确诊IgAN及膜性肾病的患者取出标本用于后续试验，入选IgAN实验组的患者均单用甲泼尼龙激素治疗，剂量根据体重计算（0.8 mg•kg-1•d-1）。患者出院后每2～4周门诊随访1次，治疗1个月随访时再次留取外周血5 mL，离心留取血清放入–80℃冰箱保存备用。

2.3 ELISA试剂盒检测：样本为上述制备的外周血血清；依据试剂盒说明书，先将标准品及血清样本各50 μL分别加入各孔中，然后每孔加入50 μL酶联亲和物，37℃温育60 min后，倒掉孔内液体；利用稀释的洗涤液反复冲洗5遍，加入显色液，室温下避光反应15 min，随后每孔加入终止液50 μL，酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值。通过标准曲线计算出Gd-IgA1的水平，以mg/L作为单位。

2.4 相关性分析：通过pearson相关性分析对IgAN患者血清Gd-IgA1水平与24 h尿蛋白量进行统计分析。

3 统计学处理 采用SPSS 19.0及Graph Pad Prism5.0软件进行统计分析和作图。正态分布计量资料以均数±标准差（mean）表示，非正态分布计量资料以中位数（最小值-最大值）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用One-way ANOVA，多个变量间的两两比较采用LSD检验。呈非正态分布的数据用非参数秩和检验。相关性分析采用pearson分析方法。

结 果

1 患者一般资料 实验组及对照组年龄、性别比例、病程等差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，IgAN组血清肌酐高于膜性肾病组，24 h尿蛋白定量低于膜性肾病组，差异均有统计学意义（P＜0.05），两组组间eGFR差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 实验组及对照组的一般资料

2 各组血清Gd-IgA1水平 根据文献，采用KM55 ELISA试剂盒检测各组血清样本Gd-IgA1水平[9]，与正常组（3.56±0.30）mg/L及膜性肾病组（3.40±0.41）mg/L相比，IgAN患者组Gd-IgA1（9.44±0.74）mg/L水平明显升高，差异具有统计学意义（P均＜0.001）；并且经激素治疗1个月后，IgAN患者Gd-IgA1（7.43±0.51）mg/L水平较治疗前下降（t=2.24，P=0.03）。正常组与膜性肾病组Gd-IgA1水平差别无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

图1 各组血清Gd-IgA1水平

3 Gd-IgA1水平与IgAN患者24 h尿蛋白定量的关系 通过相关性分析IgAN患者血清Gd-IgA1水平与24 h尿蛋白定量的关系，结果发现血清Gd-IgA1水平与24 h尿蛋白定量呈正相关（r=0.70，P=0.006，R=0.49），提示血清Gd-IgA1与IgAN患者的病情及预后相关（图2）。

图2 IgAN 患者血清Gd-IgA1水平与24 h尿蛋白定量的相关性

4 不同Haas分型患者血清Gd-IgA1水平 为进一步分析Gd-IgA1与IgAN患者病情的相关性，依据Haas分型标准[10]，将经肾活检证实为IgAN的40例患者进行分组，分别为Haas Ⅰ型、Haas Ⅱ型、Haas Ⅲ型、Haas Ⅳ型、Haas Ⅴ型，比较各组血清Gd-IgA1水平，结果发现Gd-IgA1水平与IgAN患者的肾脏病理分级相关，Gd-IgA1水平随IgAN Hass分级的升高而升高（图3）。

图3 不同Haas分型患者的Gd-IgA1水平

讨 论

由于IgA1铰链区糖基化缺陷（Gd-IgA1）在IgAN发病及疾病进展中有重要作用，国内外诸多研究小组关注Gd-IgA1的形成过程及机制。目前已明确，人体内的IgA分子具有两个亚型，分别为IgA1和IgA2，均可以单体（mIgA）和多聚体（pIgA）的形式存在。IgA1与IgA2的主要区别点在于IgA1具有铰链区，此铰链区由13个氨基酸组成，而每个铰链区又有6个O-聚糖位点，主要由苏氨酸和丝氨酸构成[11]。IgA1糖基化过程是发生在铰链区，通过β-1，3-半乳糖转移酶（C1GalT1）及其特异性分子伴侣Cosmc相互协同，由UDP-半乳糖载体将半乳糖转移至IgA1的β-1，3位乙酰基半乳糖胺残基上，完成IgA1的糖基化修饰。近年的研究证实Gd-IgA1是IgAN发生及发展中的关键致病因子，但形成Gd-IgA1的机制尚不明确[12，13]。研究表明，IgA1脱去过多的涎酸或（和）半乳糖称为低糖基化IgA1或异常糖基化IgA1，表现为O型聚糖链半乳糖基化程度降低，而N-乙酰半乳糖胺增加，这种改变很可能是由于β-1，3-半乳糖苷转移酶及其特异性分子伴侣Cosmc的功能变化及表达水平下降所致。该酶及分子伴侣活性降低时，单一N-乙酰半乳糖胺的O糖链增多，而半乳糖β1，3-N-乙酰半乳糖胺生成减少[14]。

目前研究表明，Gd-IgA1主要通过两个方面导致IgAN发生及发展，一方面肝细胞表面脱涎酸糖蛋白的受体与Gd-IgA1的结合力降低，进而肝脏对血清中Gd-IgA1的清除减少，导致其在机体内浓度升高；另一方面血清中单体Gd-IgA1聚合为大分子多聚IgA1[15]，促进了Gd-IgA1与肾小球系膜细胞、细胞外基质的结合，从而诱发一系列炎症免疫反应，最终导致肾小球系膜区Gd-IgA1沉积及IgAN发生。

此外，研究表明，IgAN发病率及严重程度与肠道菌群失调密切相关，肠道菌群失调可能会导致肠道屏障破坏，有利于毒素经肠粘膜吸收入体内，激活肠粘膜结合淋巴组织（GALT），促进局部B淋巴细胞增殖，从而Gd-IgA1分泌增多，最终导致肾小球系膜区IgA1沉积及IgAN发生[16]。已有研究报道，空肠弯曲菌和大肠杆菌等致病菌数量增加时可导致IgAN，IgAN患者血清中也常检测到某些血清型大肠杆菌[17]。小鼠体内研究证实，异常糖基化多聚体IgA和针对共生菌的特异IgA抗体大量存在于IgA肾病转基因小鼠血清中，异常糖基化多聚体IgA则会沉积在肾小球系膜区，引起IgAN发病[18]。所以，肠道菌群失调可能是Gd-IgA1产生的原因。前期研究中我们同时分析了IgAN患者与正常健康人肠道菌群的变化，发现IgAN患者存在肠道菌群失调，有益菌如乳酸杆菌、双歧杆菌及酪酸梭菌数量减少，而有害菌如梭杆菌、埃希氏杆菌及克雷伯菌数量增加。

本研究共纳入经肾组织活检证实的IgAN患者40例，膜性肾病患者20例，健康对照者20例，结果表明，IgAN患者血清Gd-IgA1水平升高，与患者的24 h尿蛋白定量呈正相关，差异均有统计学意义（P＜0.05），并且经激素治疗1个月后，IgAN患者Gd-IgA1水平较治疗前下降。且在IgAN患者中，血清Gd-IgA1水平随Hass分级的增加而升高，提示血清Gd-IgA1可在一定程度上反映IgAN患者肾脏病理改变的严重程度。激素治疗后Gd-IgA1水平较之前下降，此部分患者24 h尿蛋白量较之前减少，而正常组与膜性肾病组相比，Gd-IgA1水平无统计学意义，因此Gd-IgA1有可能成为IgAN诊断及治疗的监测标准。

综上所述，血清Gd-IgA1可以为不能行肾组织活检的患者提供一个初步诊断IgAN及判断预后的新方法，其在诊断IgAN患者的应用意义值得进一步探讨。由于研究经费的限制，本实验收集的标本量较少，观察时间尚短，希望能有更多较大规模的类似研究，尤其是纳入不同治疗阶段的患者并对患者进行长期随访等研究，为改善IgAN的治疗监测及判断预后开拓新方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突