中国汉族ADRP一家系RHO基因变异基因型及临床表型分析

张玉薇 娄桂予 杨科 阳琳 朱青 雷博

1河南省人民医院医学遗传研究所 河南省遗传性疾病功能基因重点实验室，郑州450003；2河南省人民医院 河南省眼科研究所 河南省立眼科医院，郑州 450003

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一类常见的遗传性眼病，全球患病率为1/7 000～1/3 000，其在中国的患病率约为1/4 000[1-2]。RP患者多在儿童和青少年时期发病，主要表现为夜盲、进行性视野缺损、视力下降和视网膜骨细胞样色素沉着，其病理过程为视杆细胞首先出现进行性变性，进而视锥细胞受累，最终导致视杆和视锥细胞及色素上皮功能丧失[3]。RP的诊断主要依据眼底、视网膜电图(electroretinogram，ERG)和视野检查，特殊情况可考虑光相干断层扫描检查。临床上尚无控制RP进展及治疗RP的有效方法，明确病因、植入前进行分子诊断、降低携带致病突变患儿的出生率是降低RP患病率的有效方法。RP具有高度遗传异质性，目前已鉴定的致病基因约有96个(https://sph.uth.edu/retnet/)。RP的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X染色体连锁遗传，少数患者可表现为双基因遗传及线粒体遗传[4]。由于RP表现出高度的遗传异质性和临床表型多样性，鉴定RP患者的致病基因对于正确的分类和诊断至关重要[5-6]。本研究拟对常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)一家系的致病基因和临床表型进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用家系调查研究，收集2019年11月于河南省人民医院医学遗传研究所进行遗传咨询的来自河南省东部地区的汉族RP一家系，纳入该家系4代20名成员，包括9例患者和11名表型正常者。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经河南省人民医院伦理委员会审核批准[批文号：HNEECKY-2019(15号)]，所有受检者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1临床检查 采用标准对数视力表(i.Polatest，德国Carl Zeiss AG公司)测定视力，免扩瞳眼底照相机(VISUCAM-200，德国Carl Zeiss AG公司)检查眼底，眼电生理诊断系统(RET1-Port 21 compact，德国罗兰公司)检查视网膜功能，视野分析仪(840，德国Carl Zeiss AG公司)检查视野。

1.2.2基因检测 采集先证者及家系成员外周静脉血各2 ml，置于EDTA抗凝管，混匀后按照DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)步骤提取DNA，Qubit®2.0(美国Life Technologies公司)对DNA定量。采用高通量测序仪(Ion Torrent PGM，美国ABI公司)进行基因检测。

1.2.2.1Ion AmpliSeq引物包建库及靶向测序 采用Ion AmpliSeq Designer(https://www.ampliseq.com)设计覆盖43个RP基因外显子区域，包含1 187个扩增子的AmpliSeq引物包，并由美国Life Technologies公司合成。按照Ion AmpliSeq Library Kit 2.0建库试剂盒(美国Life Technologies公司)流程对先证者进行靶向外显子建库，Qubit-dsDNA-HS试剂盒(美国Life Technologies公司)对制备的文库进行定量检测，高通量测序仪测序。采用Ion Torrent Suite v5.6系统进行Ion Torrent数据质控、序列比对及单核苷酸变异(single nucleotide variations，SNVs)和插入缺失(inserts and deletions，indels)变异检测。质控数据显示，靶向外显子平均覆盖度为99.94%，平均测序深度为300×。得到的SNVs和indels经dbSNP 138数据库过滤后，检索HGMD、NCBI等数据库匹配已报道的致病位点。对发现的可疑致病突变采用Sanger测序进行验证。

1.2.2.2PCR反应及Sanger法测序 根据变异序列采用primer blast在线(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计引物，由上海生工生物有限公司合成。扩增含有变异的外显子，对PCR片段进行纯化和测序。序列数据文件采用SeqMan Pro软件8.1.4版(DNASTAR)分析。

1.2.3数据分析 采用在线软件(http://www.mutationtaster.org/、http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和https://swissmodel.expasy.org/)预测变异位点蛋白功能及空间结构。采用ClustalW2多重比对程序对人(Genbank：NP_000530.1)、牛(Genbank：NP_001014890.1)、家犬(Genbank：NP_001008277.1)、黑猩猩(Genbank：XP_516740.2)、猫(Genbank：NP_001009242.1)及小鼠(Genbank：NP_663358.1)视紫红质(rhodopsin，RHO)蛋白的氨基酸序列进行比较(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。根据ACMG遗传变异分类标准与指南判断变异位点致病性[7]。

2 结果

2.1 家系患者临床特点

该家系4代共有9例RP患者，符合常染色体显性遗传方式(图1)。先证者，男，26岁，自幼双眼夜盲，视力右眼0.25，左眼0.5。双眼视网膜有骨细胞样色素沉着，视网膜血管变细，视盘颜色变淡(图2)；全视野ERG检查结果显示，暗适应a波和b波峰值降低；明适应a波和b波峰值重度降低；暗适应震荡电位重度下降；明适应3 ERG a、b波均重度下降；明适应30 Hz闪烁ERG右眼振幅中度下降，左眼振幅轻度下降(图3)。家系成员患者的共同表现为7～10岁开始出现夜盲，约50岁时周边视力完全丧失。

2.2 靶向基因高通量测序

该家系检测到RHO基因(NM_000539.3)5号外显子中的1个杂合错义变异c.982delC(p.L328fs)。经Mutation taster软件预测，该变异导致编码序列第328位氨基酸处的亮氨酸缺失并发生移码，改变了包括第328位氨基酸以后的21个氨基酸，造成终止密码子改变，使编码区由348个氨基酸增加到358个氨基酸，预测变异可导致蛋白结构发生改变(图4)。

2.3 RHO基因c.982delC变异Sanger测序验证及致病性分析

临床诊断为RP的患者(Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅲ8、Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ5)均检测到了c.982delC变异，无症状成员未检测到该位点变异。RHO基因编码RHO蛋白的多个同源序列比对分析表明，6个不同物种之间第328位亮氨酸残基(p.L328)均保守(图5)。根据ACMG遗传变异分类标准与指南判断：(1)缺失移码变异属于非常强的致病性证据(PVS1)；(2)该变异在ExAC和千人基因组数据库中均未被收录，属于中等致病性证据(PM2)；(3)HGMD(CM973326)和Retina International数据库(http://www.retina-international.org)曾报告RHO基因编码第328氨基酸的碱基错义致病变异，其中Leu(密码子：GAG)被Pro取代，属于中等致病性证据(PM5)；(4)家系多个患者中检测到此变异，变异与疾病在家系中共分离，属于支持致病性证据(PP1)；(5)Mutation taster软件预测该缺失移码变异偏向致病性，属于支持致病性证据(PP3)；(6)家系患病成员临床表型符合RP，属于支持致病性证据(PP4)。综上，该变异具有1个非常强的致病性证据PVS1，2个中等致病证据PM2，3个支持致病证据PP1、PP3、PP4，属于致病性变异。

3 讨论

RP是常见的眼科遗传病，在已发现的96个致病基因中，有30个基因表现为常染色体显性遗传，基因检测是对ADRP进行分子诊断的重要依据。二代测序技术是目前临床上用于检测基因变异的一种可行、省时的方法[8]。本研究采用引物包靶向扩增高通量测序的方法，与全外显子测序相比，本方法适用于单种疾病，有较高的性价比，分析有针对性，且操作快捷、简单。对于涉及几十种基因的RP，靶向包测序的方法更加适用。

本研究在该家系中检测到了RHO基因c.982delC杂合变异。RHO基因编码含有348个氨基酸的RHO蛋白，RHO是G蛋白偶联受体超家族的成员之一，RHO蛋白C端第310～349位氨基酸可与11-顺-视黄醛形成功能性发色。当光子照射到RHO时，11-顺-视黄醛异构化，在视杆细胞中启动光转导级联反应[9]，在将光能转换为电能的光转导过程中起着关键作用。C端变异影响RHO在高尔基体的转运，并损害光感受器外段的正常功能[10]。RHO蛋白C端的重要靶向序列VXPX-COOH也控制着视杆细胞外段的感光功能，其基序VXPX的缺失会导致RP[11-12]。该家系中RHO基因的c.982delC移码变异改变了高度保守的氨基酸残基328～349区域，其中包括VXPX基序，该变异很可能通过破坏RHO蛋白的正常光转导功能而致病。

RHO错义变异是RP中较常见的变异类型，在中国人群中RHO变异占所有RP病例的1.30%～5.65%，占ADRP的8.11%～15.00%[13]，而在高加索人群中，RHO变异占ADRP的16%～26%。在一项对200名西班牙RP先证者的研究中发现，27个RHO变异中有25个是错义变异[14]。在另外一项涉及中国248名RP先证者的研究中，检出的错义变异占RHO变异的87.5%(7/8)[15]。HGMD和Retina International数据库曾收录RHO基因编码第328位氨基酸的碱基错义变异，其中Leu(密码子：GAG)被Pro取代。截至目前，RHO基因的c.982delC(p.L328fs)移码变异未在大的家系中被报道。Sullivan等[16]在散发病例中检测到该变异，但未对该变异的致病性进行详细说明。另一项研究试图用高通量细胞学方法来筛选RHO在细胞中的表达以分析该变异的致病性，但并未得到确切的结果[17]。本研究为首次在中国汉族RP家系中对该变异进行验证。

RHO变异导致的RP有一定的基因型和表型的相关性。RHO中的错义变异与象限型RP相关[18]。RHO蛋白COOH末端序列的变异与早发性侵袭性RP相关[19]。本研究中RP家系的临床表现与之前报道的相似，即患者青少年时期即出现夜盲，在50多岁时出现严重视力损害，包括中心视力丧失。本家系患病成员虽然携带有相同的致病突变位点，但由于个体差异，临床表现也不尽相同，如视力、视野等。先证者的主要目的是进行遗传咨询，我们为该先证者找到了高度可疑的致病突变。以此为基础，本课题组正在构建小鼠动物模型，以进一步探索该突变的致病机制。

综上所述，本研究通过对中国汉族ADRP一家系的研究证实了RHO基因c.982delC杂合变异的致病性，该突变在中国汉族家系中首次报道。本研究为指导该家系成员的优生优育提供了分子诊断依据，并且该发现丰富了RP致病突变数据库信息，为深入研究RP的致病机制提供了新的线索。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突