外周血单核细胞自噬相关基因在急性冠脉综合征患者中的表达及临床价值*

王 丽 谭远皎，# 罗 浩 文 倩

动脉粥样硬化易损斑块破裂引发急性血栓形成，是急性冠脉综合征(ACS)发生的最主要原因。既往对ACS患者进行尸检发现死者冠状动脉粥样硬化斑块中存在大量巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞等，其中巨噬细胞是形成斑块的主要细胞来源[1]。而巨噬细胞来源于外周血单核细胞(PBMC)，因此针对PBMC相关标记物如NLRP3炎性小体、凋亡因子等进行检测，可在一定程度上反映动脉粥样硬化、急性冠脉综合征的严重程度及预后[2,3]。细胞自噬是机体针对受损细胞器降解的普遍方式，可维持机体代谢平衡。但过度的细胞自噬可促进炎症反应及细胞凋亡，导致组织器官功能失调。在心肌缺血再灌注损伤、脑卒中等动物模型中，均显示存在细胞自噬的过度激活，抑制细胞自噬，可显著减少心肌及大脑梗死面积[4,5]。目前尚未研究阐明，ACS患者体内细胞自噬水平。本研究通过分析ACS患者PBMC噬相关基因Beclin-1 mRNA和LC3-II mRNA的表达水平，探讨细胞自噬水平变化在ACS发生及发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组

选取本院2019-01—2020-10收治的ACS患者250例观察组和行健康体检的人群50例对照组作为研究对象。入选标准：所有ACS患者满足中国医师协会发布的2019版ACS诊治指南[6]。排除标准：(1)存在严重器官功能不全的患者；(2)存在自身免疫性疾病及感染的患者；(3)临床资料不完整和未签署知情同意的患者。根据ACS诊治指南将观察组患者再分为急性ST段抬高型心肌梗死组(STEMI组)92例、非ST段抬高型心肌梗死组(NSTEMI组)85例和不稳定型心绞痛组(UA)组73例。根据ACS患者预后，再将其分为存活组(n=225)和死亡组(n=25例)。对照组和观察组间在性别、年龄、体重指数、吸烟史等方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。该研究获得了本院伦理委员会的批准并征得患者及健康体检者知情同意。

表1 对照组与观察组基线资料比较

1.2 临床资料收集及治疗

患者入院后，收集一般临床资料，包括性别、年龄、体重指数、吸烟史等，根据ACS患者诊治指南，完善心肌损伤标志物、心电图、心脏超声等检查，给予经皮冠脉介入、双联抗血小板、调脂、营养心肌等治疗。

1.3 观察指标

1.3.1 自噬相关基因mRNA水平检测：入院即刻收集观察组患者和行健康体检时对照组人群外周血2ml，经抗凝离心后，得到PBMC，采用TRIzol试剂提取总RNA，然后进行逆转录， qPCR引物由上海生工公司合成，引物序列如下，Beclin-1上游引物：5'-GG CTG AGA GAC TGG ATC AGG-3'，下游引物：5'-CTG CGT CTG GGC ATA ACG-3'； LC3-II上游引物：5'-GAG AAG CAG CTT CCT GTT CTGG-3'，下游引物：5'-GTG TCC GTT CAC CAA CAG GAA G-3'； GAPDH上游引物：5'-GGA CTG ACC TGC CGT CTA G-3'，下游引物：5'-TAG CCC AGG ATG CCC TTG A-3'。建立20 μl反应体系，反应条件：预变性，95℃120s，95℃5s，60℃30s，35个循环；以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt方法计算mRNA相对水平。

1.3.2 外周血炎性指标检测：入院即刻收集观察组患者和行健康体检时对照组人群外周血2ml，经离心后取上清液，采用武汉博士德生物公司购买的试剂盒检测炎症指标白细胞介素-17(IL-17)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，试剂批号分别为EK0403、EK0525，具体检测步骤仪器和试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 对照组和观察组外周血自噬相关基因和炎性指标水平比较

与对照组比较，观察组PBMC中自噬相关基因Beclin-1和LC3-II mRNA及炎性指标IL-17和TNF-α均显著升高(P<0.01)，见表2。

表2 两组对象外周血自噬相关基因mRNA和炎性指标水平比较

2.2 不同分型ACS患者外周血自噬相关基因和炎性指标水平比较

STEMI组、NSTEMI组和UA组间外周血自噬相关基因Beclin-1和LC3-II mRNA及炎性指标(IL-17和TNF-α)水平比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，其中STEMI组上述指标最高，NSTEMI组次之，UA组最低，差异均有统计学意义(t均>6.11,P均<0.01)，见表3。

表3 三组患者外周血自噬相关基因mRNA和炎性指标水平比较

2.3 不同预后组间外周血自噬相关基因和炎性指标水平比较

与存活组比较，死亡组患者外周血自噬相关基因Beclin-1和LC3-II mRNA及炎性指标(IL-17和TNF-α)水平显著升高(P<0.05)，见表4。

表4 不同预后组间外周血自噬相关基因和炎性指标水平比较

2.4 相关性分析

观察组患者外周血自噬相关基因Beclin-1和LC3-II mRNA分别与IL-17、TNF-α呈显著正相关(P均<0.01)，见表5。

表5 相关性分析

2.5 ROC曲线分析

Beclin-1mRNA预测ACS患者发生死亡的AUC为0.788(95%置信区间，0.702-0.874)， 敏感性和特异性分别为75.51%和76.79%，最佳的临界点是1.87。而LC3-II mRNA预测ACS患者发生死亡的AUC为0.774(95%置信区间，0.674-0.873)， 敏感性和特异性分别为72.73%和78.57%，最佳的临界点是1.85。见图1。

图1 ROC曲线分析

3 讨 论

目前，心脑血管疾病仍是超越恶性肿瘤引起患者发病和死亡的主要疾病，其中ACS因其发病急，预后差，是临床常见的急危重症。易损的动脉粥样硬化斑块破裂和继发血栓形成是ACS发生的主要原因。尽管早期预防及诊断是降低ACS患者发病率和死亡率的主要方法，同时医院“胸痛中心”的设立也为该类患者的救治提供了紧急通道，但如何有效预测ACS患者病情变化及预后，仍是制约其防治的关键。近年来，相关研究人员致力于研究ACS的病理生理机制，发现具有较高敏感性的生物标志物可为疾病病情的评估和相关诊治提供重要的靶标[7,8]。本研究结果显示，细胞自噬的激活参与ACS的发生及发展过程，通过检测PBMC自噬水平，对ACS患者预后的评估，具有较高的敏感性和特异性。

近年来，相关研究已显示细胞自噬参与了多种疾病如神经退行性疾病、恶性肿瘤、动脉粥样硬化等的病理生理过程[9-11]。在器官(心肌、肝脏、大脑)缺血再灌注损伤中，细胞自噬显著激活，可促进下游炎症及氧化应激级联反应，进一步促进细胞凋亡，通过有效的抑制细胞自噬，可显著减少器官梗死面积[12-14]，因此，通过检测患者外周血PBMC自噬相关基因的表达水平，可反映组织器官缺血缺氧程度。本研究结果显示，ACS患者PBMC自噬水平显著高于健康对照组，表明ACS患者细胞自噬显著激活，可能参与了ACS疾病的发生过程。同时在不同ACS疾病亚组中，随着病情严重程度的增加，细胞自噬及炎性指标水平逐渐升高，特别是STEMI和NSTEMI患者显著高于UA患者，表明细胞自噬水平可能与ACS患者粥样硬化斑块破裂引发血栓形成，从而引起的心肌细胞功能受损程度存在一定相关性。已有研究表明，心脏缺血再灌注损伤模型中，细胞自噬显著激活，其水平与心肌梗死面积呈显著正相关，而与心脏射血分数呈显著负相关[15]。有学者发现炎症性疾病如脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征患者PBMC自噬水平升高对患者预后，具有较高的评估价值，且敏感性和特异性分别为75.96%和80.49%[16]。本研究采用PBMC自噬相关基因对ACS患者预后评估的敏感性和特异性分别72.73%和78.57%及75.71%和76.79%，可在一定程度上预测患者预后。

本研究存在一定局限性：(1)ACS患者中自噬激活的分子机制尚不清楚，还需要动物及细胞实验进一步研究；(2)本研究样本量偏少，同时也是单中心研究，希望下一步加大样本量，采取多中心研究予以证实PBMC自噬对ACS患者预后的评估价值。

综上所述，PBMC自噬相关基因Beclin-1mRNA和LC3-II mRNA在ACS患者中的表达水平显著升高，该指标对ACS患者预后评估具有一定的临床参考价值。

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