1例B(A)亚型血型鉴定及分析*

瞿 珍 何鸣镝 赵 磊 许婷婷

ABO血型系统是于1900年第一种被发现的人类血型[1]，也是到目前为止最广为人知、研究最为广泛、最具临床意义的血型系统[2]。根据红细胞表面有无A、B抗原及血清中有无抗A、抗B抗体可将ABO血型分为A型、B型、AB型、O型。红细胞上A、B抗原的异常表达会导致ABO亚型的产生。ABO亚型的及时发现及准确鉴定是目前ABO血型系统在输血医学中的主要课题。

按照2019版《血站技术操作规程》，献血前采集血液标本进行检测，检测项目包括血红蛋白、ALT、ABO血型等，检测合格方可献血。同时留取血清学检测标本管和核酸检测标本管交由实验室进行后续相关检测。近期，笔者用全自动血型分析仪PK7300进行血型筛查时发现一例标本，正反鉴定一致为B型，与纸片法初筛血型不一致(AB型)，送本中心输血研究室鉴定。经鉴定试管法血型血清学为B(A)亚型，正反不一致，后经测序证实为B(A)亚型，PK7300存在亚型漏检，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源

无偿献血者张某某，女，22岁，汉族，未婚，无输血、妊娠、手术史。符合《献血者健康检查要求》。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器：PK7300全自动血型分析系统(美国Beckman公司)；离心机(日本久保田公司)；高速台式离心机(美国Thermo公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；电泳仪(上海天能科技有限公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；ABI 9700 PCR仪(美国ABI公司)；ABI 3730 型基因分析仪(美国ABI公司)；nono-100分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.2.2 试剂：单克隆抗-A、抗-B标准血清(批号：102182)，反定红细胞(批号：115408c，美国Immucor公司)；单克隆抗-A、抗-B、抗-H标准血清(批号：20201208)，反定红细胞，筛选红细胞(自制，上海血液生物)；血液基因组DNA柱式小量提取试剂盒(江苏伟禾生物科技有限公司)；人类ABO血型基因分型检测试剂盒(PCR-SBT法，江苏伟禾生物科技有限公司)。

1.3 血型鉴定

1.3.1 纸片法：用两滴单克隆抗血清和一滴手指血在血型板反应圈内混匀，观察结果。

1.3.2 PK7300全自动血型分析仪法：根据文献报道的方法[3]，利用全自动加样功能，正定型血型检测用25μl标准血清与25μl红细胞悬液反应，反定型血型检测用25μl A、B、O 标准红细胞悬液与血浆25μl反应。加样结束后，30℃孵育、静置1h，然后血型仪通过CCD 系统图像数字化处理后，以判别是否发生凝集，软件自动判读及汇总正反定型结果。结果检测出正反定型均为B型。

1.3.3 试管法：根据文献报道的方法[4]，对样本进行试管法正反定型鉴定。正定型加两滴单克隆血清，然后加一滴先证者3%-5%红细胞悬液；反定型加两滴血浆和一滴3%-5%的红细胞悬液，混匀后立即离心观察结果。

1.3.4 基因测序：采用血液基因组DNA柱式小量提取试剂盒，采用江苏康为世纪生物科技有限公司血液基因组试剂盒，对ABO基因第6及7外显子序列扩增，扩增条件为第一步1个循环，95℃，2min30s，第二步35个循环，94℃，1s，65℃信号采集点，55s，对PCR产物直接测序。采用 ExoSAP-IT (Thermo) 纯化ABO基因、将PCR产物纯化,将纯化PCR产物用作测序反应DNA模板，在ABI 3730型基因分析仪检测分析，采用Chromas软件阅读图谱，Clone Manager软件比对和分析测序结果，将测序结果与人类红细胞血型基因数据库[5]中收录的基因序列进行比对，判断测序结果基因型以及是否存在新的 ABO 血型基因多态性位点。使用的引物和扩增条件、测序工作均由江苏伟禾生物科技有限公司负责完成。

2 结 果

2.1 纸片法结果

纸片法检测该献血者血型为AB型。

2.2 PK7300全自动血型仪血型检测结果

PK7300全自动血型仪检测该献血者血型正反定型一致，均为B型，见图1。

图1 PK7300全自动血型仪血型检测结果

2.3 试管法血型检测结果

正定型显示有A、B抗原，单克隆抗A强反应，人源抗A弱反应；反定型Ac端强反应显示先证者血清中有较强的不规则抗A抗体。这些血清学特征符合B(A)的血清学反应格局。

2.4 基因测序检测结果

对该标本进行第 1-7 外显子直接测序，综合结果判定以A101为参考序列，得到结果如下: 第7外显子 700C/G (图1)是较B基因型增加的碱基替换，证实该献血者ABO血型的基因型为 B(A).02/O.01.02。见图2。

图2 ABO血型基因测序结果

3 讨 论

自1900年，Landstiner发现人类第一个红细胞血型系统以来，ABO血型系统一直是最重要的血型系统，在移植医学、法医学、临床输血等方面发挥重要的作用。随着检测技术的不断提高，越来越多的ABO亚型不断被发现，其中B(A)血型是一种非常罕见的ABO亚型，1993年，Yamamoto[6]等首次发现一种能够编码正常糖基转移酶B的ABO等位基因，同时具有A糖基转移酶的活性，这个等位基因被命名为B(A)01。2012年已经报道的B(A)等位基因有6个[7]，其中B(A)02、B(A)04-06基因型均首先在中国人群中发现。

表1 献血者标本试管法正反定型结果

血清学方法鉴定ABO血型是依据兰德斯坦纳法则通过检测抗原和抗体来确定血型，当基因突变时有可能会产生ABO亚型，大多数亚型与兰德斯坦纳法则不完全相符，于是会造成正反定型不相符的情况。不同的亚型具有不同的血清学反应特点，我们依据这些特点来判断亚型的类型。B(A)的血清学反应特点有：(1)A抗原较弱，与人源抗-A反应弱，但与单克隆抗体反应可能会增强；(2)有强反应性的不规则抗-A抗体，反定型Ac端常常呈强阳性。这种情况很容易出现正反定型相符，导致该亚型被漏检从而误判为B型。

目前各血站都引进不同厂家的全自动血型分析仪进行血型检测，有NEO、PK7300、Metis-200、Microlab STAR IVD等等，不同设备的方法学也不尽相同。NEO、Metis采用U型微板法，PK7300采用梯板法。U型微板法样本和试剂加入微板后通过离心振荡得到直观的反应结果，梯板法样本和试剂往往需要稀释,反应后通过静置得到反应结果。在本实验室中，献血者血型复检采用PK7300全自动血型分析仪。按照仪器厂家提供的参数，市售血型正反定型检测试剂都需要稀释，稀释之后抗体效价会降低，对一些亚型或者弱凝集，正定型检测因为抗A抗B凝集较弱，仪器可能会判定不凝集，反定型检测因为本身抗体较弱或者被稀释，可能一些弱凝集反应不明显，可能导致仪器检测出来的血型和实际的血型不一致，这种情况就会导致亚型漏检或者血型鉴定错误，给输血安全带来风险。本案例就是由于PK7300对A抗原检测的漏检导致血型误判为B型。曾有血站报道过使用Galileo全自动血型仪进行ABO血型鉴定时确实也有B(A)亚型漏检的情况发生[8]。

为确保输血安全，准确鉴定血型具有重要意义。临床输血中，我们提倡交叉配血相合性输注，这类亚型往往会导致交叉配血不和，所有此类血液往往没有发往临床。通过本案例的分析讨论，笔者认为献血者的血型检测，应采用高质量单克隆抗体检测试剂，建议采用不同的实验方法以及不同厂家的试剂复检[9]，避免因实验方法的局限以及单一试剂引起弱的血型抗原漏检。同时应兼顾试剂、人员、检测方法等，增加技术培训，提高实验技能，尽可能避免亚型漏检，以确保输血安全。

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