过表达miR-21对脂多糖诱导人牙髓干细胞炎症、凋亡和自噬的影响

林玉祥，林慧，车立纯，田河

1 厦门医学院附属口腔医院牙体牙髓病二科，福建厦门361000；2 厦门市口腔疾病诊疗重点实验室；3 青岛市中心医院口腔科

人牙髓干细胞（hDPSCs）具有自我更新能力、高增殖能力及多向分化能力［1］，具有众多潜在的临床治疗作用，但炎症微环境会限制其各种自我更新及分化能力，从而影响其应用［2］。微小RNA（miRNA）是一类内生的、长度为20～24 个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。miRNA 表达与hDPSCs 的增殖、多向分化、衰老和其他生命过程均密切相关［3］。研究显示，miR-21 广泛参与机体炎症、凋亡、自噬等多种病理生理过程［4-6］。NARA等［7］研究发现，miR-21 可减轻脂多糖（LPS）诱导的hDPSCs 炎症反应。但是，miR-21 对hDPSCs 炎症反应、凋亡和自噬的影响鲜见报道。为此，我们于2020 年6 月—2021 年2 月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：hDPSCs 购自上海赛百慷生物技术股份有限公司。质粒：miR-21 mimics、miR-NC mimics均购自广州锐博生物技术有限公司。主要试剂：白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，DMEM 培养基、10%胎牛血清、青—链霉素、LPS均购自美国Sigma公司；胰蛋白酶购自美国Gibco 公司，Hoechst 染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Annexin V-FITC/PI 双染色细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，BCA 试剂盒购自北京百奥莱博科技公司；CD34、CD45、CD90、CD105 抗体均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，裂解的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、死骨片1（p62）、自噬微管相关蛋白轻链3 抗体（LC3B）、内参GAPDH 一抗及辣根过氧化酶标记的IgG均购自英国Abcam公司。

1.2 hDPSCs 细胞培养及鉴定 将hDPSCs 置于含10% 胎牛血清和青—链霉素双抗的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中。每隔3 d 传代1次，取第3～4 代、生长状态良好的细胞，胰酶消化，收集细胞，离心半径8 cm，1 000 r/min 离心5 min，PBS 洗涤，重悬细胞。向相应流式管中加入CD34、CD45、CD90、CD105抗体，通过流式细胞仪检测细胞表面标志物表达情况。结果显示，hDPSCs细胞表面高表达CD90、CD105，低表达CD34、CD45，证实该细胞为hDPSCs。见OSID码图1。

1.3 LPS 浓度筛选 取生长良好的第3～4 代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集细胞并制成细胞悬液，以2×103/孔接种于96 孔板中。培养过夜后，分别加入不同浓度LPS（0、0.1、1、5、10 μg/mL），作用48 h。收取细胞上清液，使用ELISA 试剂盒检测细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。结果显示，与0 μg/mL LPS 作用后比较，hDPSCs 经0.1、1、5、10 μg/mL LPS 作用后细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高，且不同浓度间比较P均＜0.05。见表1。结合文献报道，10 μg/mL LPS可显著降低hDPSCs的细胞存活率［8］。因此，选定5 μg/mL LPS进行后续实验。

表1 hDPSCs经不同浓度LPS作用后细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，± s ）

表1 hDPSCs经不同浓度LPS作用后细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，± s ）

注：与0 μg/mL LPS作用后比较，*P＜0.05。

LPS浓度0 μg/mL 0.1 μg/mL 1 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL IL-1β 135.68 ± 6.74 185.38 ± 11.28*284.95 ± 8.08*845.62 ± 37.89*924.02 ± 77.42*IL-6 54.00 ± 5.22 87.31 ± 8.27*261.05 ± 22.53*376.70 ± 15.20*460.10 ± 20.47*TNF-α 15.90 ± 2.62 61.63 ± 8.19*100.59 ± 2.98*136.96 ± 7.86*171.72 ± 19.26*

1.4 细胞分组处理 取生长良好的第3～4代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集细胞并制成细胞悬液，以1×104/孔接种于96 孔板中。待细胞生长至70% 左右，随机分为对照组、LPS 组、LPS+miR-NC mimics组、LPS+miR-21 mimics 组，LPS+miR-NC mimics 组、LPS+miR-21 mimics 组分别使用Lipofectamine 2000转染试剂转染miR-NC mimics、miR-21 mimics。各组作用4 h，更换为含10% 胎牛血清的DMEM 培养基，LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组、LPS+miR-21 mimics 组均加入5 μg/mL LPS，置于培养箱中继续培养48 h。

1.5 细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平检测 采用ELISA 法。收集各组细胞上清液，使用ELISA 试剂盒检测IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。取生长良好的第3～4 代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集细胞并制成细胞悬液，以1.5×104/孔接种于24 孔板中，按照1.4进行分组处理。胰酶消化后收集细胞，PBS洗涤，加入Binding buffer 缓冲液100 μL，重悬细胞。向细胞混悬液中加入Annexin V-FTIC 溶液5 μL，混合均匀，避光孵育10 min。向细胞中加入PI 5 μL，轻轻混匀，室温避光孵育15 min。置于冰浴中，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 细胞凋亡及自噬相关蛋白表达检测 采用Western blotting 法。取生长良好的第3～4 代hDPSCs，胰蛋白酶消化，收集细胞并制成细胞悬液，以7×105/孔接种于24孔板中，按照1.4进行分组处理。胰酶消化后收集细胞，加入RIPA 裂解液，37 ℃水浴30 min，离心后取上清，使用BCA 蛋白质定量试剂盒检测蛋白浓度。将30 μg 蛋白上样进行SDS-PAGE电泳分离，并转移到PVDF 膜上。5% 脱脂牛奶封闭1 h，TBST 洗涤3 次。加入Cleaved Caspase-3、p62、LC3B、GAPDH（稀释比例分别为1∶500、1∶200、1∶3 000、1∶5 000）一抗，4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，加入二抗孵育1 h，TBST洗涤3次。ECL发光，凝胶成像系统成像分析条带灰度值。以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用Student-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比较 见表2。

表2 各组细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，± s ）

表2 各组细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，± s ）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与LPS组及LPS+miR-NC mimics组比较，#P＜0.05。

组别对照组LPS组LPS+miR-NC mimics组LPS+miR-21 mimics组IL-1β 138.73 ± 3.86 780.05 ± 14.45*782.61 ± 20.20*404.87 ± 22.18*#IL-6 60.06 ± 8.82 426.36 ± 48.72*425.42 ± 85.83*194.35 ± 24.39*#TNF-α 9.50 ± 1.06 163.29 ± 30.77*193.05 ± 17.39*29.18 ± 6.02*#

2.2 各组细胞凋亡率比较 对照组、LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组、LPS+miR-21 mimics 组细胞凋亡率分别为1.4% ± 0.2%、30.8% ± 1.3%、31.5% ±0.8%、10.4% ± 0.9%；与对照组比较，LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组、LPS+miR-21 mimics 组细胞凋亡率均升高，且LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组升高更明显（P均＜0.05）。

2.3 各组细胞凋亡和自噬相关蛋白表达比较 见表3。

表3 各组细胞Cleaved Caspase-3、p62、LC3B蛋白相对表达量比较（± s ）

表3 各组细胞Cleaved Caspase-3、p62、LC3B蛋白相对表达量比较（± s ）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与LPS组及LPS+miR-NC mimics组比较，#P＜0.05。

组别对照组LPS组LPS+miR-NC mimics组LPS+miR-21 mimics组Cleaved Caspase-3 0.59 ± 0.05 1.33 ± 0.15*1.32 ± 0.14*0.73 ± 0.07*#p62 0.91 ± 0.08 0.12 ± 0.02*0.13 ± 0.01*0.61 ± 0.05*#LC3BⅠ0.98 ± 0.06 0.28 ± 0.04*0.27 ± 0.04*0.66 ± 0.05*#LC3BⅡ0.37 ± 0.03 0.94 ± 0.11*0.95 ± 0.09*0.53 ± 0.06*#

3 讨论

hDPSCs具有多向分化的潜力，能够分化成牙本质细胞、脂肪细胞和神经细胞。近年来，干细胞治疗和再生医学取得了巨大进展。临床研究结果表明，hDPSCs 对于牙髓和牙周组织再生以及颌面部骨组织缺损修复是安全有效的［1］。LPS 是革兰阴性细菌细胞壁的组成成分，是牙髓炎的重要致病因子。研究证实，LPS 可以使hDPSCs 产生大量炎症因子，诱导发生细胞炎症反应［9］。本研究结果显示，LPS可刺激hDPSCs 生成IL-1β、IL-6 和TNF-α，并呈剂量依赖性。因既往文献报道，10 μg/mL LPS 可显著降低hDPSCs 的细胞存活率［8］。因此，本研究选定5 μg/mL LPS 进行后续实验。研究显示，多种miRNA 参与了牙髓组织炎症反应的调节过程［10］。在牙髓炎的发生过程中，牙髓组织中多种miRNA 表达改变均可影响hDPSCs 的活性和分化潜能［11］。SONG 等［12］研究显示，miR-21 介导了LPS 刺激人牙髓成纤维细胞的炎症过程［13］。本研究结果显示，与对照组比较，LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组、LPS+miR-21 mimics组细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高，且LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组升 高更明显；表明LPS 可诱导hDPSCs 分泌IL-1β、IL-6 和TNF-α，而过表达miR-21可以显著抑制LPS诱导的炎症反应。

细胞凋亡在生物体进化、内环境稳定及多个系统发育中均具有重要作用［14］。有研究表明，细胞凋亡参与调控牙胚组织和牙源性细胞的发育［15］。Caspase-3 是细胞凋亡过程中最重要的末端剪切酶，在正常组织中以非活性方式存在，但在凋亡途径中会被激活［16］。本研究结果显示，与对照组比较，LPS组、LPS+miR-NC mimics 组、LPS+miR-21 mimics 组细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3表达均升高，且LPS组、LPS+miR-NC mimics 组升高更明显；表明LPS 可诱导hDPSCs 细胞凋亡，而过表达miR-21 可以显著抑制LPS 诱导的细胞凋亡。既往研究显示，miR-21可以通过降低Bax/Bcl-2 和Caspase-3 活性来抑制LPS诱导的肾细胞凋亡，与本研究结果一致［17］。

细胞炎症反应将刺激各种自噬相关蛋白的表达变化，从而参与炎症发病机制的调控。LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在临床多用于评估自噬水平。p62作为自噬的选择性底物，可进入自噬体并在自噬后期被降解，因此其表达水平通常与自噬水平呈负相关关系。研究显示，LPS 和成骨诱导液可通过上调hDPSCs中LC3B、p62和Beclin1等自噬相关蛋白表达，而促进hDPSCs 的分化和基质矿化［18］。本研究结果显示，与对照组比较，LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组、LPS+miR-21 mimics 组细胞LC3B Ⅱ表达均升高，p62、LC3BⅠ表达均降低，且LPS 组、LPS+miR-NC mimics 组变化更明显；提示LPS 通过上调LC3BⅡ、下调p62 和LC3BⅠ蛋白表达来诱导hDPSCs 发生自噬，而过表达miR-21 可以通过抑制细胞自噬而保护hDPSCs免受LPS的损害。

综上所述，LPS 可诱导hDPSCs 发生炎症反应，并促进其凋亡和自噬，而过表达miR-21 可以抑制LPS 的上述作用。本研究不仅为研究牙髓炎反应的病理损伤提供了理论依据，也为预防和治疗牙髓病提供了实验依据。