胆碱对肠系膜上动脉缺血再灌注大鼠血管损伤的影响及其分子机制

逯星竹，赵阳，李楠，毕学苑

1 西安交通大学第二附属医院药学部，西安710004；2 西安交通大学第二附属医院药物临床研究机构办公室；3 西安交通大学附属红会医院药剂科

缺血再灌注（IR）损伤是心血管领域的重要研究课题，现已成为治疗缺血性心血管疾病亟待解决的关键问题。血管损伤是再灌注损伤的重要特征，改善血管功能和结构可能成为防治心血管IR损伤的新方向［1］。胆碱是体内必不可少的营养元素，广泛参与机体各种生物学进程。近年来研究发现，胆碱具有心血管保护作用，能够延缓心肌肥大的病理进程，抑制心肌细胞增大及有害的心肌重构［2］。还有研究表明，胆碱具有延缓心脏衰老的作用［3］。此外，胆碱可通过抑制Akt/mTOR通路减轻IR诱导的心肌细胞凋亡和自噬［4］。本课题组前期研究结果显示，胆碱能够改善IR 导致的血管功能障碍［5］，但其作用机制还需深入探究。2019年10月—2020年12月，本研究建立大鼠肠系膜上动脉IR 模型，观察胆碱对血管损伤的影响并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雄性健康SD 大鼠36 只，体质量（220 ± 20）g，8～10 周龄，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。主要试剂：胆碱购自美国Sigma 公司，PKR 样内质网激酶（PERK）购自美国Cell Signaling Technology 公 司，磷 酸 化PERK（p-PERK）购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司，免疫球结合蛋白（Bip）购自英国Abcam 公司，磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）购自美国Cell Signaling Technology 公司，磷酸化AMPK（p-AMPK）购自美国Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 购自北京华肽先锋生物科技有限公司，二抗抗小鼠、抗兔购自北京中杉金桥生物技术有限公司，乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，BCA 试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，蛋白Maker 购自美国Ferments 公司，ECL 发光液购自美国Millipore 公司，戊巴比妥钠购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器：Synexgy HT 型酶标仪购自美股Bio-TEK公司，电泳仪购自美国General Electric公司。

1.2 模型建立与分组处理 选择健康雄性SD大鼠36 只，实验前24 h 禁食，自由饮水。将大鼠随机分为假手术组、IR 组和胆碱治疗组，各12 只。IR 组建立大鼠肠系膜上动脉IR 模型。方法如下：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg 进行麻醉后，仰卧位固定于操作板上，消毒后腹正中切口，分离肠系膜上动脉；在肠系膜上动脉根部用无创伤血管夹夹闭，阻断肠系膜上动脉血流60 min，然后松夹，再灌注90 min。胆碱治疗组根据体质量舌下静脉注射胆碱10 mg/kg，10 min 后参照上法建立肠系膜上动脉IR模型。假手术组仅开腹，分离肠系膜上动脉，不进行夹闭。各组实验结束后，在显微镜下迅速分离肠系膜上动脉作为研究标本；部分肠系膜上动脉常规固定后制成切片，病理观察血管结构和形态；部分大鼠肠系膜上动脉经短暂液氮冻存后，-78 ℃保存备用。

1.3 血管组织病理观察 采用HE 染色。将分离的肠系膜上动脉置于10% 中性甲醛中，4 ℃固定48 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋与切片。常规进行HE 染色，中性树胶封片。每组大鼠选取6 张切片标本，光镜下观察血管结构和形态学变化。

1.4 血清LDH 水平检测 采用比色法。各组分离肠系膜上动脉后，于腹主动脉抽取血液3 mL，静置30 min 后，常温条件下3 500 r/min离心15 min，分离血清。参照LDH 试剂盒说明书，使用多功能酶标仪检测LDH 水平，LDH 水平越高提示血管内皮细胞损伤越严重。

1.5 肠系膜上动脉组织PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK 检 测 采 用Western blotting 法。取各组冻存的肠系膜上动脉组织，将2～3 根肠系膜上动脉血管合并为一组，置于1.5 mL EP 管中。称重剪碎后用组织匀浆机研磨，加入RIPA 裂解液，蛋白抽提试剂提取蛋白，BCA 法进行蛋白定量。进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳结束后转膜至0.45 μm PVDF膜，5 %脱脂牛奶或5% BSA 室温封闭1 h。加入PERK、p-PERK、Bip、AMPK、p-AMPK 及内参GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育过夜；加入抗小鼠（1∶5 000）或抗兔（1∶5 000）二抗，室温孵育1 h。ECL发光法进行成像，Gel-Pro软件进行条带分析，计算目的蛋白相对表达量及p-PERK/PERK、p-AMPK/AMPK。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间和组内比较分别采用成组t检验和配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血管内皮损伤病理结果比较 假手术组大鼠肠系膜上动脉血管形态完整，血管内皮细胞未见异常；与假手术组比较，IR 组大鼠血管内皮细胞存在空泡变性、炎性浸润，血管内皮细胞脱落；与IR 组比较，胆碱治疗组大鼠肠系膜上动脉血管形态较完整，内皮细胞恢复正常，其病理改变介于假手术组和IR组之间。见OSID码图1。

2.2 各组大鼠血清LDH 水平比较 假手术组、IR组和胆碱治疗组大鼠血清LDH 水平分别为（430.96 ± 36.45）、（713.47 ± 87.98）、（449.38 ±50.39）U/L，IR 组大鼠血清LDH 水平明显高于假手术组和胆碱治疗组（P均＜0.05），假手术组和胆碱治疗组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组大鼠肠系膜上动脉PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比较 IR组大鼠肠系膜上动脉p-PERK/PERK、Bip 表达均高于胆碱治疗组、假手术组，p-AMPK/AMPK 低于胆碱治疗组、假手术组（P均＜0.05），胆碱治疗组、假手术组上述指标比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。三组PERK、AMPK 表达比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1、OSID码图2。

表1 各组大鼠肠系膜上动脉PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比较（± s）

表1 各组大鼠肠系膜上动脉PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比较（± s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与IR组比较，#P＜0.05。

组别假手术组IR组胆碱治疗组n 4 4 4 PERK 0.40 ± 0.08 0.44 ± 0.08 0.45 ± 0.06 p-PERK/PERK 0.48 ± 0.14 0.82 ± 0.19*0.44 ± 0.14#Bip 0.18 ± 0.05 0.36 ± 0.05*0.21 ± 0.07#AMPK 0.56 ± 0.11 0.60 ± 0.09 0.53 ± 0.11 p-AMPK/AMPK 0.54 ± 0.06 0.31 ± 0.02*0.54 ± 0.08#

3 讨论

IR 诱导的血管损伤不仅降低了再灌注所带来的益处，反而会进一步加重组织结构及功能受损。胆碱作为人体每日必需营养元素，一直为机体提供抵御外界损伤的防护作用，以往对胆碱的研究主要集中在其对心肌的保护作用，近年来关于其对血管的保护效应逐渐成为研究热点。研究发现，胆碱能够抑制平滑肌细胞的表型转化，进而减轻血管重塑［6］；还能够下调自发性高血压大鼠肠系膜上动脉中白细胞介素6 和肿瘤坏死因子α 表达，能恢复自发性高血压大鼠的压力反射敏感性和血清乙酰胆碱水平［7］。以上研究提示，胆碱具有血管保护作用，并可能作为一种潜在的心血管疾病辅助治疗方法。本课题组前期研究发现，胆碱能够通过调节细胞钙流向而减轻血管受损及IR 导致的血管功能异常，并指出胆碱的心血管保护作用是通过激活M3 型乙酰胆碱受体而发挥作用的［5］。LDH 是机体中非常重要的糖酵解酶，细胞损伤时，LDH 水平异常增高，因此检测血清LDH 水平能够反映血管内皮细胞的损伤程度。本研究结果显示，与IR 组比较，胆碱治疗组大鼠肠系膜上动脉血管形态较完整，内皮细胞恢复正常，其病理改变介于假手术组和IR 组之间，且假手术组和胆碱治疗组血清LDH水平明显低于IR组；提示胆碱能够降低IR大鼠血清LDH水平，改善血管内皮细胞损伤，减轻IR诱导的外周血管损伤。

内质网是细胞内蛋白质生成和加工的主要场所，Bip/葡萄糖调节蛋白78（GRP78）属于内质网热休克反应蛋白70 家族，是一种ATP 依赖的伴侣蛋白［8］。Bip/GRP78 是调节内质网功能的主要蛋白之一，对维持内质网的稳态必不可少，对促进蛋白质正确折叠也至关重要，是激活未折叠蛋白反应的感受器［9］。正常情况下，Bip 与双链RNA 活化的蛋白激酶PKR 样内质网激酶［（PKR）-PERK］结合，不能与异常折叠蛋白结合；内质网应激发生时存在ATP 水解，使Bip 与异常折叠蛋白之间形成稳定复合物，从而释放PERK，并引发下游的级联反应［10-11］。研究显示，PERK 可通过细胞质内结构域二聚化和自身磷酸化而被激活［12］。研究指出，糖尿病大鼠发生心肌IR后，未折叠蛋白反应激活，GRP78和PERK 磷酸化水平升高，氧化苦参碱预处理能够减轻内质网应激相关的细胞凋亡［13］。本研究结果显示，胆碱预处理能够降低IR 导致的PERK/Bip 通路活化，减轻内质网应激反应，并发挥血管保护作用。

AMPK 在级联激活的情况下，会增强应激状态下对细胞的保护作用［14］。IR 的主要靶细胞是心血管内皮细胞和平滑肌细胞，均可直接或间接受到AMPK 调控［15-16］。因此，激活AMPK 信号通路是心血管疾病治疗的潜在靶点。研究表明，AMPK 可能是抑制内质网应激相关凋亡通路的重要环节，部分药物能够通过激活AMPK通路抑制内质网未折叠蛋白反应的发生，减轻细胞凋亡，从而发挥保护作用，同时该研究提示AMPK 可能是PERK/Bip 的上游信号分 子［17-19］。 已有 研究 证实，胆 碱可 通过SIRT3/AMPK 通路调节酮体和脂肪酸代谢，从而减轻心功能障碍、减少心肌肥厚的发生［20］。本研究结果显示，胆碱能够使肠系膜上动脉IR大鼠血管组织p-AMPK蛋白表达升高，增加AMPK活性，提示胆碱可能是通过活化AMPK而减轻IR损伤的。

综上所述，胆碱能减轻大鼠肠系膜上动脉IR 导致的血管损伤，改善内皮细胞形态和结构，降低LDH 水平，从而发挥血管保护作用，其机制可能与抑制PERK/Bip信号通路、活化AMPK有关。