黄连素对IL-1β诱导炎性退变软骨细胞增殖的影响及其分子机制

黄文，马石庭，姚军

1 贺州市人民医院骨关节与运动医学科，广西贺州542800；2 广西医科大学第一附属医院骨关节外科

骨关节炎（OA）是一种好发于膝关节，以关节疼痛和功能障碍为主要特点的退行性关节炎，可致关节严重畸形［1］。研究显示，全球OA 患者已经超过3.6 亿，其中80% 的患者存在运动局限性，25% 存在肢体残疾［2］。OA 的主要病理基础是软骨细胞损伤、凋亡，导致细胞外基质合成分泌减少［3-4］。目前研究认为，炎症因子蓄积在OA 的发生、发展中具有重要作用，是导致软骨细胞病变的主要原因［5］。黄连素是从毛茛科植物黄连根茎中提取出的一种生物碱，临床显示具有清热解毒的作用［6］。近些年研究显示，黄连素具有较强的抗炎作用［7-8］。但黄连素对OA 是否有治疗作用，目前尚缺乏相关研究。2019年12 月—2020 年12 月，本研究观察了黄连素对白细胞介素1β（IL-1β）诱导软骨细胞炎性退变的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：1 周龄C57 小鼠8 只，雌雄不限，由广西医科大学实验动物中心提供。主要试剂：细胞染色相关试剂（DMSO、MTT、FDA 染料）均购自美国Sigma 公司，细胞培养相关试剂（黄连素、DMEM 高糖培养基、0.25% 胰蛋白酶、胎牛血清、胶原酶Ⅱ、青—链霉素混合液、PBS 溶液）均购自北京Solarbio 公司，RT-PCR 相关试剂（细胞RNA快速提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒）均购自美国Thermo Scientific 公司，Western blotting 相关试剂（细胞总蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、一抗、二抗）均购自北京中杉金桥科技有限公司。主要仪器：超净细胞操作台购自苏州苏洁净化设备公司，CO2培养箱、MultiSkan 酶标仪、ABI 7500 型定量PCR 仪均购自美国Applied Biosystems 公司，荧光倒置显微镜购自日本Olympus 公司。

1.2 小鼠膝关节软骨原代细胞提取、培养及鉴定

1.2.1 软骨原代细胞提取、培养 将8 只C57 小鼠处死后置入75%乙醇内浸洗5 min，在超净操作台内解剖取出小鼠膝关节处软骨组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块。 将组织块放入含0.25% 胰蛋白酶的无菌离心管中，37 ℃条件下消化1 h；800 r/min 离心2 min 后去上清液，加入2 mg/μLⅡ型胶原酶，继续消化2 h。反复吹打后收集消化液，800 r/min 离心2 min 后去上清液，用PBS 溶液重悬细胞。将细胞接种于含DMEM 培养基（内含10%FBS、1% 青—链霉素）的培养皿，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后更换培养基，之后每3 d换液1次。细胞融合至80% 时以1∶2 比例传代，取第3 代细胞进行以下实验。

1.2.2 软骨细胞鉴定 将生长状况良好的第3 代软骨细胞接种于细胞爬片培养，2 d 后取出爬片，普通光学显微镜下观察细胞基本形态，结果显示细胞形态多样，呈类圆形、多角形、星形等。将爬片置入4% 多聚甲醛中，4 ℃条件下固定30 min，取出爬片，反复用PBS 清洗，每次3～5 min；清洗完毕后将爬片置入甲苯胺蓝染色液中，充分覆盖样品，室温避光孵育30 min；显色至预期深浅后去除染色液，用蒸馏水洗涤1～2 次，光学显微镜下观察，结果可见细胞质呈蓝色，细胞质丰富、细胞核清晰，多核。见OSID 码图1。

1.3 黄连素作用浓度筛选 采用MTT 法。选取生长状况良好的第3 代软骨细胞配成单细胞悬液，以5×103/孔接种于96 孔板培养，培养1 d 后，更换含不同浓度黄连素（0～102.4 g/L）+IL-1β（10 ng/mL）的培养基进行培养。 培养1 d 后，将终浓度为5 mg/mL 的MTT 加入96 孔板内，37 ℃孵育箱中孵育4 h 后终止培养。小心吸除孔内培养基，向孔中加入150 μL 二甲基亚砜，震荡10 min 后使用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm 处的吸光度值，以吸光度值表示软骨细胞活性。结果显示，＞0～0.8 g/L 的黄连素对炎性退变的软骨细胞具有低细胞毒性，6.25×10－3～0.05 g/L 的黄连素可浓度依赖性提高炎性退变的软骨细胞活性（P均＜0.05），1.6～102.4 g/L 的黄连素对炎性退变的软骨细胞活性有抑制作用（P均＜0.05）。选择浓度为6.25×10－3g/L、0.05 g/L 黄连素分别作为低、高剂量进行下一步研究。见图1。

图1 炎性退变的软骨细胞经不同浓度黄连素作用后的细胞活性（MTT法）

1.4 细胞分组处理 将软骨细胞随机分为空白组（不采取任何干预）、模型组（仅加入10 ng/mL IL-1β干预）、黄连素低剂量组（10 ng/mL IL-1β +6.25×10-3g/L黄连素干预）、黄连素高剂量组（10 ng/mL IL-1β+0.05 g/L黄连素干预），分组处理后继续培养2 d。

1.5 细胞增殖活性检测 采用FDA 荧光染色。各组培养2 d后取出细胞爬片，用PBS将爬片轻柔清洗干净，置入FDA（100 mg/L）染色液中，暗盒内染色5 min，在倒置荧光显微镜下摄片分析活细胞数。绿色斑点为活细胞，相同接种底数，绿色斑点越多表示活细胞数越多，即增殖活性越强。

1.6 软骨细胞分泌功能检测 采用番红O 染色。各组培养2 d后取出细胞爬片，用PBS将爬片轻柔清洗干净，置入40 g/L多聚甲醛中固定30 min，固定结束再次清洗爬片，去除甲醛。按照番红O 染色操作手册，将软骨细胞染色至预期深浅后，在倒置光学显微镜下摄片分析番红O 染色面积。番红O 可将软骨细胞分泌的外基质染为红色，颜色越深、染色面积越大表示软骨细胞分泌功能越强。

1.7 软骨细胞特异性相关基因［蛋白聚糖（Acan）、Ⅱ型胶原1（Col2a1）］及炎症相关基因［基质金属蛋白酶13（MMP-13）、环氧合酶2（COX-2）］表达检测 采用Real-time PCR 法。各组培养2 d后，按照细胞RNA 快速提取试剂盒完成总RNA 提取，反转录合成cDNA。Acan 引物序列：上游引物5'-GGCAACAACTCACCCAGCACTG-3'、下 游 引 物5'-AGGAGGCACGGGACGTAGTTC-3'，Col2a1 引 物序列：上游引物5'-CCAAGTGGCCAGGTTCAACG-3'、下 游 引 物5'-GGGATGAGGAATGCGCCCTA-3'，MMP-13 引物序列：上游引物5'-CCGGGAGAACAATCCGTGCC-3'、下游引物5'-AAAGCACTCGCCATCCCCAA-3'，COX-2 引 物 序 列：上 游 引 物5'-CAGGTGCAAAGCCCAGCGAC-3'、下 游 引 物5'-TGGGGCTCCAAGTCCATTGTT-3'，内参β-actin 引物序列：上游引物5'-CATGAGCCGAAGCTAACCC-3'、下游引物5'-CTCCTATGACTTCTGCGTCTGG-3'。PCR 反应条件：50 ℃预变性2 min，95 ℃预变性10 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火1 min，40 个循环。采用2－ΔΔCt法计算软骨细胞目的基因相对表达量。

1.8 转化生长因子β（TGF-β）/Smad2/3 信号通路相关蛋白表达检测 采用Western blotting 法。各组培养2 d 后，按照细胞总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒进行定量。参照试剂盒说明书进行电泳、转膜、封闭，加入TGF-β1、Smad2、Smad3、β-actin 一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入二抗（稀释比例均为1∶5 000），室温孵育1 h。曝光、显影后采用Image Lab 图像处理软件对目的条带进行分析，以β-actin 为内参，计算各组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用Graphpad 6.0 统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组软骨细胞增殖活性比较 模型组、空白组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组活细胞数分别为（212.50 ± 17.68）、（375.00 ± 35.35）、（530.00 ±42.43）、（650.00 ± 70.71）个，组间两两比较P均＜0.05。见OSID码图2。

2.2 各组软骨细胞分泌功能比较 模型组、空白组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组染色面积分别为24.50% ± 4.95%、44.50% ± 6.36%、65.00% ±7.07%、77.5% ± 3.53%，组间两两比较P均＜0.05。见OSID码图3。

2.3 各组软骨细胞Acan、Col2a1、MMP-13 及COX-2 mRNA 表达比较 模型组、空白组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组软骨细胞Acan、Col2a1 mRNA表达依次升高，MMP-13、COX-2 mRNA 表达依次降低，组间两两比较P均＜0.05。见表1。

表1 各组软骨细胞Acan、Col2a1、MMP-13及COX-2 mRNA表达比较（± s）

表1 各组软骨细胞Acan、Col2a1、MMP-13及COX-2 mRNA表达比较（± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与黄连素低剂量组比较，△P＜0.05。

组别空白组模型组黄连素低剂量组黄连素高剂量组Acan 1.00 ± 0.14 0.58 ± 0.08*1.28 ± 0.11*#1.57 ± 0.10*#△Col2a1 1.00 ± 0.07 0.49 ± 0.13*1.36 ± 0.08*#1.61 ± 0.08*#△MMP-13 1.00 ± 0.11 1.75 ± 0.07*1.08 ± 0.04*#0.67 ± 0.09*#△COX-2 1.00 ± 0.15 1.80 ± 0.11*0.88 ± 0.09*#0.57 ± 0.06*#△

2.4 各组软骨细胞TGF-β/Smad2/3 信号通路蛋白表达比较 模型组、空白组、黄连素低剂量组、黄连素高剂量组软骨细胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白相对表达量均依次升高，组间两两比较P均＜0.05。见表2、OSID码图4。

表2 各组软骨细胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达比较（± s）

表2 各组软骨细胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达比较（± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与黄连素低剂量组比较，△P＜0.05。

组别空白组模型组黄连素低剂量组黄连素高剂量组TGF-β1 0.55 ± 0.07 0.25 ± 0.04*0.78 ± 0.05*#1.04 ± 0.12*#△Smad2 0.43 ± 0.11 0.20 ± 0.07*0.65 ± 0.08*#0.77 ± 0.04*#△Smad3 0.38 ± 0.09 0.17 ± 0.57*0.48 ± 0.85*#0.62 ± 0.09*#△

3 讨论

在OA 的发展过程中有各种细胞因子的产生，并参与干扰软骨细胞分解代谢和合成代谢过程。关节内部不仅有炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13、IL-17、COX-2）诱导的分解代谢过程，同时还存在抗炎因子（IL-4、IL-10、IL-13）诱导的合成代谢过程［9］。尽管炎症和抗炎因子在OA 发病过程中的细胞间和细胞内信号通路尚不明确，但既往研究已证实早期OA已经具有不同程度的炎症反应［10］。

研究表明，具有抗炎作用的中药提取物可以减轻细胞炎症，改善软骨细胞功能，促进软骨合成及修复。台湾学者发现龟鹿二仙胶具有强效抗炎作用，可以明显改善小鼠OA 病情［11］；李淑洁等［12］研究发现，牛膝提取物可能通过PI3K/AKT 信号通路抑制软骨细胞凋亡，从而减轻碘乙酸钠对软骨细胞的损伤。此外，淫羊藿素、枸杞多糖、牛膝总皂苷也有相似作用［13-15］。 本研究结果显示，黄连素在6.25×10-3～0.05 g/L 时可呈浓度依赖性提高炎性退变软骨细胞的活性，并促进细胞增殖；此外，黄连素可逆转IL-1β 引起的软骨细胞炎症因子MMP-13、COX-2 mRNA 高表达，促进软骨合成因子Acan、Col2a1 表达，番红O 染色进一步表明黄连素可促进发生炎性退变的软骨细胞合成细胞外基质；这表明黄连素对软骨细胞及软骨修复均具有积极作用。

TGF-β1是TGF-β 超家族成员，Smad1、Smad2 是Smad 蛋白家族的重要成员，TGF-β/Smad2/3 信号通路参与调控许多细胞（如软骨细胞、成纤维细胞、上皮细胞等）的增殖、分化［16-17］。Smad 蛋白可以将TGF-β 信号由细胞外传导至细胞核，从而调节靶基因转录水平，干预细胞功能状态。既往已有许多研究表明，TGF-β/Smad2/3 激活可促进软骨细胞增殖、合成Ⅱ型胶原蛋白和聚集相关的蛋白多糖，在软骨合成及修复中具有重要作用；其机制主要是TGFβ/Smad2/3 信号通路激活可上调转录因子Sox9，从而增加Ⅱ型胶原分泌，减少蛋白多糖消耗，最终促进软骨细胞外基质合成，起到修复软骨的作用［18-20］。本研究结果显示，炎性退变的软骨细胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表达量均有不同程度的下调，这可能是因为细胞在炎性因子干扰下的自我修复功能受损所致；而黄连素可以促进发生炎性退变的软骨细胞合成TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白，从而正向调控软骨细胞的增殖。

综上所述，黄连素可促进IL-1β诱导炎性退变软骨细胞的增殖及活性，其机制可能与抑制炎症反应及激活TGF-β/Smad2/3信号通路有关。黄连素可促进软骨修复，减轻OA病变，是治疗OA的潜在药物。