微炎症环境中肠上皮细胞与巨噬细胞共培养后MAPK、NF-κB通路改变及意义

陈玉娇，晏杰

1 连云港市第二人民医院检验科，江苏连云港222023；2 广州医科大学附属第二医院过敏反应与免疫重点实验室

肠上皮屏障和黏膜巨噬细胞是肠道固有免疫的重要组成部分，在肠道稳态与炎症反应之间维持重要的平衡作用。正常状态下，免疫系统对肠道分布的共生菌群免疫耐受，对侵入到肠道的微生物能及时产生免疫应答；而炎症性肠病（IBD）患者对肠道共生微生物等无害抗原呈现出异常过激的免疫应答，导致黏膜耐受崩溃［1］。一直以来对IBD 的研究主要关注于炎症状态下过度的免疫反应，而固有免疫抗原提呈系统产生免疫耐受、维持肠道稳态的机制研究甚少。因此，探究肠上皮细胞和单核巨噬细胞之间的相互作用机制对于揭示肠道稳态的机制至关重要［2］。HYUN 等［3］发现，巨噬细胞和肠道上皮细胞之间存在相互交流，可以促进白细胞介素10（IL-10）分泌，但这种细胞间的交流具体通过什么方式、由哪个或哪些分子介导目前尚不明确。人结肠腺癌上皮细胞株Caco2、HCA7 具备分化的小肠上皮细胞结构和功能，具有与体内细胞相同的细胞极性和紧密连接，且较易在Transwell 孔上形成连续的极化单层肠上皮细胞的特性，在肠道上皮屏障功能、肠道稳态以及肠上皮细胞与肠黏膜下免疫细胞相互作用机制等研究领域得到广泛使用［4-6］。2018 年10 月—2020 年5 月，本研究观察了上皮细胞与单核巨噬细胞共培养时对彼此MAPK 和NF-κB 通路的影响，为探究固有免疫系统在维持黏膜免疫平衡中的机制提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人结肠腺癌上皮细胞株Caco2、HCA7 及人白血病单核巨噬细胞株THP1 均购自中国科学院细胞生物学研究所。主要试剂：胎牛血清、DMEM（高糖、低糖）、RPMI 1640、无血清培养基、BCA 蛋白定量试剂盒、SYBR qPCR 试剂盒均购自美国Thermo 公司，肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子购自美国R&D 公司，蛋白转运抑制剂（BFA）购自美国MCE 公司，磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（p-p38）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白α（p-IκBα）、磷酸化核蛋白（p-p65）、内参β-tubulin一抗及辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗均购自美国CST公司；逆转录cDNA 合成试剂盒购自中国Transgen公司，RT-PCR 引物由中国擎科公司设计合成，带荧光标记的单抗白细胞介素8（IL-8）-FITC、CC 亚族趋化性细胞因子（CCL）-APC、细胞内因子染色固定破膜试剂盒购自美国BD 公司。主要仪器：12 孔Transwell小室购自美国Corning公司，流式细胞仪购自美国BD 公司，酶标仪、细胞培养箱均购自美国Thermo公司，q-PCR仪购自德国罗氏公司，PowerPac 3000型蛋白电泳仪购自美国Bio-Red 公司，细胞电阻仪购自美国Millipore公司。

1.2 细胞培养和极化 使用高糖DMEM 完全培养基（含10% 胎牛血清及1% 双抗）培养Caco2细胞，使用低糖DMEM 培养HCA7 细胞，使用RPMI 1640 培养THP1 细胞，均置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数 生 长 期的Caco2、HCA7，以2×105/孔铺在Transwell 上室，使Transwell 上室和下室充盈细胞培养基，培养1周待上皮细胞极化，电阻仪测量电阻达到1 000 Ωm2时进行下一步共培养。

1.3 微炎症环境中极化的上皮细胞与THP1 单独及共培养后MAPK、NF-κB通路改变的观察

1.3.1 细胞培养及TNF-α 刺激 取对数生长期的THP1 细胞，以2×106/孔铺于12 孔板，给1.2 中Transwell 上室内极化的上皮细胞Caco2、HCA7 换液，并置于THP1 细胞悬液上，以模拟肠道上皮组织内上皮细胞和单核巨噬细胞的空间分布，培养箱共孵育过夜。第2 天加入TNF-α（5 ng/mL）于Transwell 下室中，设置同等条件下Caco2、HCA7 单独培养的Transwell 上室和THP1 单独培养的下室作为单独培养对照，同时给予TNF-α（5 ng/mL）刺激。

1.3.2 细胞MAPK 通路（p-ERK、p-p38）及NF-κB通路（IκBα、p-IκBα、p-p65）相关蛋白表达检测 采用Western blotting 法。取1.3.1 中分别单独及共培养后的Caco2、HCA7、THP1，在梯度时间点刺激后收集细胞（根据两种上皮细胞信号通路激活快慢不同，Caco2 的TNF-α 刺激时间分别为0、15、30、90 min，HCA7的TNF-α刺激时间分别为0、15、30、120 min）。分别提取Transwell 下室和上室细胞总蛋白，蛋白定量后取40 μL 样品，加入上样缓冲液和β-巯基乙醇煮样10 min。常规电泳、转膜，5% 脱脂奶粉封闭后，依次加入p-ERK、p-p38、p-IκBα、p-p65 一抗（稀释比例均为1∶1 000）及内参β-tubulin 一抗（稀释比例为1∶2 500），4 ℃摇床孵育过夜。 次日PBST 漂洗10 min×3 次，加入二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育1 h。ECL 显影液在凝胶成像仪上曝光成像，计算目的蛋白相对表达量。

1.4 微炎症环境中经Caco2 条件培养基孵育后的THP1 细胞MAPK、NF-κB 通路及细胞因子表达变化的观察

1.4.1 THP1细胞分组处理及TNF-α刺激 在细胞培养箱正常培养Caco2 细胞1～2 d 后，收集培养上清，即Caco2 条件培养基。取对数生长期的THP1 细胞，分为Caco2 培养基组和DMEM 培养基组，离心后分别重悬于Caco2 条件培养基和DMEM 完全培养基。将两组细胞以2×106/孔均匀铺于12 孔板，孵育过夜后加入TNF-α（5 ng/mL），分别刺激0、15、30、120 min。

1.4.2 细胞MAPK 通路及NF-κB 通路相关蛋白表达检测 参照1.3.2 采用Western blotting 法检测两组细胞p-ERK、p-p38、p-IκBα、p-p65 等蛋白表达。

1.4.3 细胞TNF-α 相关细胞因子（IL-8、IL-6、IL-1β）和趋化因子（CCL2、CCL3）mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。两组细胞经TNF-α 刺激0、60 min时，采用TRIzol 试剂提取总RNA，用逆转录cDNA 合成试剂盒合成cDNA。PCR 引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，40个循环。

表1 TNF-α相关细胞因子和趋化因子引物序列

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以-x± s 表示，组间和组内比较分别采用成组t检验和配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α 刺激下单独或共培养后的Caco2、THP1细胞MAPK、NF-κB 通路相关蛋白表达比较 见表2、3。

表2 TNF-α刺激下单独或与THP1共培养后的Caco2细胞MAPK、NF-κB通路相关蛋白表达比较（-x ± s）

表3 TNF-α刺激下单独或与Caco2共培养后的THP1细胞MAPK、NF-κB通路相关蛋白表达比较（-x ± s）

2.2 TNF-α刺激下单独或共培养后的HCA7、THP1细 胞MAPK、NF-κB通路相关蛋白表达比较 见表4、5。

表4 TNF-α刺激下单独或与THP1共培养的HCA7细胞MAPK、NF-κB通路相关蛋白表达比较（-x ± s）

2.3 两组细胞MAPK、NF-κB 通路相关蛋白表达比较 见表6。

表6 两组细胞MAPK、NF-κB通路相关蛋白表达比较（± s ）

表6 两组细胞MAPK、NF-κB通路相关蛋白表达比较（± s ）

注：与同组刺激0 min比较，*P＜0.05；与DMEM培养基组刺激相同时间比较，#P＜0.05。

组别DMEM培养基组0 min 15 min 30 min 120 min Caco2培养基组0 min 15 min 30 min 120 min p-ERK 13 011.0 ± 789.3 10 830.9 ± 632.3 17 297.7 ± 1 281.1*14 906.8 ± 983.2*11 103.4 ± 789.2 10 277.2 ± 568.3 13 012.6 ± 1 326.1*#11 147.4 ± 942.2#p-p38 720.3 ± 100.3 9 395.6 ± 683.2*17 619.4 ± 1 726.3*9 115.8 ± 353.2*1 015.3 ± 98.3 6 649.2 ± 267.1*7 707.6 ± 131.2*#6 542.9 ± 231.3*#p-IκBα 777.5 ± 211.2 1 258.3 ± 198.2 1 422.4 ± 242.3 6 096.2 ± 584.2*944.4 ± 93.1 849.1 ± 111.3 1 120.4 ± 211.1 1 014.2 ± 942.1#p-p65 1 283.3 ± 231.1 11 413.4 ± 384.2*8 936.6 ± 742.2*8 677.7 ± 289.2*7 694.8 ± 985.2 12 888.8 ± 1 673.2*8 401.0 ± 568.3 3 863.3 ± 342.1*#

2.4 两组细胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA表达比较 见表7。

表7 两组细胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA相对表达量比较（± s ）

表7 两组细胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA相对表达量比较（± s ）

注：与同组刺激0 min比较，*P＜0.05；与DMEM培养基组刺激相同时间比较，#P＜0.05。

组别DMEM培养基组0 min 60 min Caco2培养基组0 min 60 min IL-8 1.00 ± 0.04 17.62 ± 0.17*1.71 ± 0.04 7.80 ± 0.19 *#IL-6 0.93 ± 0.18 1.94 ± 0.19*2.42 ± 0.67 2.51 ± 1.96 IL-1β 0.91 ± 0.03 7.25 ± 0.81*1.43 ± 0.32 1.76 ± 0.14#CCL2 1.00 ± 0.08 3.95 ± 0.25*1.61 ± 0.10 1.83 ± 0.04#CCL3 1.00 ± 0.01 6.82 ± 0.54*2.44 ± 0.02 6.72 ± 0.67*

3 讨论

目前关于IBD、类风湿关节炎（RA）等自身免疫性疾病的研究大多关注于炎症反应严重阶段，治疗手段仅起到抑制炎症、缓解症状的作用，并不能根治疾病［7］。在正常健康的肠道中，由于抗原负荷巨大，接触抗原的肠道上皮和黏膜抗原提呈细胞（APC）在稳定状态下维持一种致敏或低反应状态，从而维持黏膜稳态［8］。寻找上皮细胞和巨噬细胞在维持黏膜稳态这一过程中发挥调节作用的关键分子或许能给治疗IBD、RA等自身免疫性疾病带来新的希望。

TNF-α主要由活化的巨噬细胞分泌，与RA、IBD等多种疾病的发生发展密切相关［9-10］。研究表明，某些药物可以通过作用于TNF-α 下游的MAPK 和NFκB 通路，而发挥抑制巨噬细胞活化的抗炎作用［11］。本研究通过低剂量TNF-α 刺激，模拟肠道稳态中的微炎症反应状态，同时模拟体内两种细胞空间分布，构建共培养体系，以探究此环境下细胞内相关信号通路的激活机制。结果发现，TNF-α 刺激单独培养的上皮细胞Caco2、HCA7后，MAPK和NF-κB通路相关蛋白均在对应时间点上调；与HCA7 互相作用的THP1细胞中检测的NF-κB通路蛋白是IκBα、p-p65，IκBα 是p-IκBα 的前体蛋白，单独培养时IκBα 在120 min 表达降低，提示有相当一部分转化为p-IκBα；而将Caco2、HCA7和THP1在Transwell体系中共培养后，Caco2、HCA7 细胞中代表通路激活的磷酸化关键蛋白表达均被抑制，与HCA7 共培养的THP1细胞IκBα 在120 min时的表达并未降低，提示IκBα转化为p-IκBα的过程受抑制；以上均提示上皮细胞和巨噬细胞能相互交流，并可通过某种方法抑制对方MAPK、NF-κB 通路的激活。肠上皮细胞与黏膜免疫细胞间的交流方式包括可溶性介质介导、胞间直接接触及胞间连接等［12］，探究细胞间沟通方式，有助于寻找它们相互调节的靶点。因此，在下一阶段试验中，我们收集了Caco2 条件培养基与THP1

共培养，结果发现MAPK 和NF-κB 两条通路的激活仍被抑制；这说明Caco2 在正常状态下能分泌一种或多种可溶性介质，以抑制微炎症状态下巨噬细胞的免疫应答，实现对无害抗原的耐受。

表5 TNF-α刺激下单独或与HCA7共培养后的THP1细胞MAPK、NF-κB通路相关蛋白表达比较（-x ± s）

IL-8、CCL2、IL-1β、IL-6 及CCL3 均是由巨噬细胞、上皮细胞等分泌的，可以募集炎症细胞浸润的趋化因子或者促进炎症的细胞因子［13］。IBD 患者肠组织中巨噬细胞数量明显增加，且分泌大量细胞因子及生物活性物质，如IL-1、IL-6 等。肠道巨噬细胞能够介导炎症反应，其过度活化会引起炎症反应的调控失衡［14-15］。MCP1 即单核细胞趋化蛋白1，又称CCL，包括CCL2、CCL3 等，与趋化性细胞因子、IL-8均可由炎症介质刺激的单核巨噬细胞、成纤维细胞、黏膜上皮细胞分泌，主要功能是引起由巨噬细胞介导的慢性炎症，在黏膜感染、急慢性炎症和超敏反应中发挥重要作用［16］。本研究结果显示，DMEM 培养基组在TNF-α 刺激60 min 后细胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA 相对表达量均升高，但Caco2 培养基组在TNF-α 刺激60 min 后细胞IL-8、IL-1β、CCL2 mRNA 相对表达量较DMEM 培养基组均明显降低。上述结果提示，上皮细胞可以分泌可溶性介质抑制巨噬细胞分泌促炎因子，减少募集其他免疫细胞。本研究中，Caco2 培养基组在TNF-α 刺激60 min 后 细 胞IL-6、CCL3 mRNA 相 对 表 达 量 与DMEM 培养基组比较均无明显差异。最新研究发现，肌细胞可分泌IL-6调控肌动蛋白，肌肉收缩时IL-6可起到抗炎效果［17-18］，肠上皮内包含平滑肌纤维，可能是导致本研究两组IL-6表达无差异的原因之一。

综上所述，微炎症环境中肠上皮细胞Caco2、HCA7 和巨噬细胞THP1 共培养后各细胞MAPK 和NF-κB 通路激活及促炎因子分泌均被抑制，从而实现对肠道无害抗原的耐受；该抑制作用不依赖于细胞间直接接触，而是通过分泌可溶性介质介导。本研究对固有免疫系统维持肠道稳态的免疫耐受机制提供了新的见解，下一步拟用超滤管对条件培养基中不同大小的可溶性介质进行筛选，为临床治疗自身免疫性疾病提供新方法。