EZH2基因表达对ox-LDL诱导内皮细胞炎症反应的影响

李扬，林飞，2，3，陈志刚，2，3，常峥峥，赵奕霖，李东旭，2，李雪芳，2，孙四玉，赵国安，2，3

1 新乡医学院第一附属医院生命科学研究中心，河南新乡453100；2 河南省心血管损伤与修复国际联合实验室；3 河南省心脏生物医学工程研究中心

冠心病及其并发症是心血管疾病患者最主要的死因，动脉粥样硬化（AS）是冠心病的病理基础，内皮细胞炎症是AS 的发病基础［1-4］。因此，研究内皮细胞炎症形成的相关机制具有重要意义［5］。AS 是一种表观遗传学疾病，其发病机制涉及组蛋白修饰、DNA 甲基化、长链非编码RNA 等［6］。在组蛋白修饰过程中，Zeste 同源复合物2（EZH2）可通过三甲基化组蛋白3的27位（H3K27）改变基因表达，敲除EZH2可抑制前列腺癌、淋巴细胞瘤等肿瘤生长。研究显示，在高脂饮食的ApoE－/－小鼠中使用EZH2 抑制剂后，小鼠主动脉粥样斑块明显减少［7］；这提示EZH2参与了AS 的发生发展，但EZH2 是否通过影响内皮细胞炎症而参与AS 目前尚不明确。2019 年1 月—2021 年1 月，本研究采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）构建内皮细胞炎症模型，通过在细胞中过表达和低表达EZH2 基因，观察EZH2 表达对内皮细胞炎症反应的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及内皮细胞培养基（ECM）均购自美国Science Cell 公司，ox-LDL 购自广州奕源生物科技有限公司，BCA试剂、ELISA 试剂盒、EZH2 蛋白一抗均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，EZH2、白细胞介素6（IL-6）、IL-8、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、一氧化氮合酶（e-NOS）、C 反应蛋白（CRP）及内参GAPDH 引物均购自苏州金唯智生物科技有限公司，cDNA 反转录试剂盒购自上海近岸科技有限公司，PCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公司，EZH2 腺病毒及对照腺病毒购自加拿大Abm 公司，EZH2 特异性抑制剂GSK126购自美国Selleck公司。

1.2 ox-LDL 诱导浓度筛选 将HUVEC 置于含有10% 胎牛血清和1% 青—链霉素双抗的DEME 培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养、传代。取传至3～7 代、生长融合至50% 左右的HUVEC，接种至大皿中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。第二天吸弃 废 液，PBS 冲 洗 两 遍，分 别 加 入0、25、50、100 μg/mL ox-LDL，培养12、24 h时分别收集细胞上清。采用ELISA 法检测上清IL-6 水平，严格按照试剂盒说明书操作。结果显示，相同作用时间下，HUVEC 经25、50、100 μg/mL ox-LDL 作用后上清IL-6水平均明显高于0 μg/mL ox-LDL 作用后，以100 μg/mL ox-LDL作用后上清IL-6水平升高最显著（P均＜0.05）；因0 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后上清IL-6 水平升高，说明无ox-LDL 作用的细胞培养24 h时可能已存在炎症反应，为了排除细胞本身已存在炎症反应对实验的影响，选择100 μg/mL ox-LDL 作用12 h作为后续实验条件。见表1。

表1 HUVEC经不同浓度ox-LDL作用12、24 h时上清IL-6水平比较（pg/mL，-x ± s）

1.3 EZH2 过表达对ox-LDL 诱导内皮细胞炎症反应的促进作用观察

1.3.1 细胞分组及EZH2 过表达处理 将生长融合至70% 左右的HUVEC 接种至大皿中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。第二天吸弃废液，PBS冲洗两遍，分为实验A 组、阳性对照A 组、阴性对照A 组和空白A 组。实验A 组、阳性对照A 组分别转染EZH2 腺病毒及对照腺病毒（病毒感染系数设为75），与DEME 培养基共培养3 h 后换液，PBS 冲洗两遍，加入DEME 培养基培养48 h，提取RNA 及蛋白检验显示腺病毒转染成功后，加入100 μg/mL ox-LDL 作用12 h。阴性对照A 组加入100 μg/mL ox-LDL作用12 h，空白A组常规培养12 h。

1.3.2 细胞EZH2 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。取各组细胞，用预冷PBS 冲洗两遍，加入100 μL预先配好的裂解液，收集到1.5 mL离心管中。冰浴30 min，每5 min用移液枪吹打均匀。待细胞充分裂解后，4 ℃条件下12 000 r/min 离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。按照BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定总蛋白质浓度。加 入1/4 体积 的5×Lodding buffer，100 ℃金属 浴10 min，自然冷却后放入-20 ℃冰箱备用。等量上样，10% SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（20 μg/孔）、5% SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（30 μg/孔）进行电泳，转移至PVDF 膜，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h。加入EZH2 及β-actin 一抗（1∶3 000），室温孵育过夜；使用TBST 清洗PVDF 膜后，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。化学发光凝胶成像系统成像显影，Image J进行灰度值分析，计算EZH2蛋白相对表达量。

1.3.3 细胞EZH2 及炎症指标IL-6、TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA 表达检测 采用Real-time PCR 法。取各组细胞，预冷PBS 冲洗两遍后，TRIzol 法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计检测260/280 nm 波长处吸光度，测量RNA 浓度及纯度后合格后，采用两步法进行反转录。PCR 反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，40 ℃退火5 s，60 ℃延伸31 s，共40 个循环。采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 细胞上清IL-6水平检测 采用ELISA法。取各组细胞，4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，取上清，-20 ℃冰箱保存备用。在康宁板中使用1×Capture Antibody 包被，4 ℃冰箱过夜。弃液后，加入ELISA/ELISPOT（1×）封闭1 h，加入稀释好的标准品，其余孔加入各组细胞上清100 μL；孵育2 h后加入1×Detection Antibody，封闭1 h后加入1×Streptavidin-HRP，封闭30 min后加入1×TMB Solution，反应15 min。使用酶联免疫检测仪测450 nm波长吸收值，根据标准品浓度及标准品波长制作标准曲线及曲线公式，将各样品波长吸收值代入公式计算得到IL-6水平。

1.4 EZH2 低表达对ox-LDL 诱导内皮细胞炎症反应的抑制作用观察

1.4.1 细胞分组及EZH2 低表达处理 将HUVEC分为实验B 组、阳性对照B 组、阴性对照B 组和空白B 组。在5 mg GSK126 中加入0.949 4 mL 二甲基亚砜（DMSO），配成10 mmol/L 的储备液，-20 ℃冰箱备用。取50 μL 储备液，加入50 mL 培养基，配成后制备成GSK126工作液（浓度10 μmol/L）。实验B组直接加入GSK126 工作液7 mL，阳性对照B 组加入7 mL 培养基及DMSO 7 μL（实验组中工作液含0.1% DMSO，故阳性对照B 组中培养基加入含0.1% DMSO 作阳性对照），培养48 h 后，提取RNA及蛋白检验是否低表达成功，再加入ox-LDL 100 μg/mL 作用12 h。阴性对照B 组加入ox-LDL 100 μg/mL作用12 h，空白B组常规培养12 h。

1.4.2 细胞EZH2蛋白及各炎症指标表达检测 参照1.3.2采用Western blotting法检测细胞EZH2蛋白表达，参照1.3.3 采用Real-time PCR 法检测细胞EZH2、TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP、IL-6 mRNA表达，参照1.3.4采用ELISA法检测细胞上清IL-6水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间和组内比较分别采用成组t检验和配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EZH2过表达后ox-LDL诱导内皮细胞EZH2及各炎症指标表达比较

2.1.1 各组细胞EZH2 mRNA、蛋白表达及上清IL-6 水平比较 见表2。

表2 各组细胞EZH2 mRNA、蛋白表达及上清IL-6水平比较（-x ± s）

2.1.2 各组细胞TNF- α、e-NOS、IL-8、CRP、IL- 6 mRNA表达比较 见表3。

表3 各组细胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表达比较（± s ）

表3 各组细胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表达比较（± s ）

注：与空白A组比较，*P＜0.05；与阴性对照A组、阳性对照A组比较，#P＜0.05。

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2.2 EZH2低表达后ox-LDL诱导内皮细胞EZH2及各炎症指标表达比较

2.2.1 各 组 细 胞TNF- α、e-NOS、IL-8、CRP、IL-6 mRNA表达比较 见表4。

表4 各组细胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表达比较（± s ）

表4 各组细胞TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP mRNA表达比较（± s ）

注：与空白B组比较，*P＜0.05；与阴性对照B组、阳性对照B组比较，#P＜0.05。

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2.2.2 各组细胞EZH2 mRNA、蛋白表达及上清IL-6水平比较 见表5。

表5 各组细胞EZH2 mRNA、蛋白表达及上清IL-6水平比较（-x ± s）

3 讨论

内皮细胞在AS 形成中具有重要作用，内皮细胞炎症损伤后，细胞通透性增加，细胞间连接变得宽松，使得巨噬细胞通过内皮细胞间隙，吞噬脂质后进入斑块内部，从而促进粥样硬化斑块形成［8-9］。TNF-α、e-NOS、IL-8、CRP、IL-6 等细胞炎症因子在炎症反应中具有核心作用，上述因子不仅招募趋化因子，促使巨噬细胞通过内皮细胞间隙进入血管内壁，且其可以招募生长因子，进一步加速斑块形成，最终促进AS形成［10］。因此，内皮细胞炎症途径引起AS 发病的相关机制研究及相关通路靶点阻断可以为AS 的预防及治疗提供可参数据。本研究通过ox-LDL刺激HUVEC 而构造内皮细胞炎症模型，结果显示100 μg/mL ox-LDL作用12 h为最佳作用条件。

现代研究显示，表观遗传调控参与AS 的形成、发生和发展［11］，其中EZH2 作为聚梳阻抑复合物2（PRC2）的核心成分，可通过调控表观遗传参与内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、迁移以及巨噬细胞极化，最终参与AS形成与发展。研究显示，EZH2通过介导lncRNA OIP5-AS1，促进ox-LDL 诱导的血管内皮细胞凋亡［12-13］。EZH2 还可通过调节ATG5、ATG7和MEK-ERK112信号通路传导，从而抑制细胞自噬、促进血管平滑肌细胞凋亡；同时，EZH2 能够抑制ABCA1 表达，从而升高巨噬细胞中的脂质水平［14-15］。但目前鲜见关于EZH2 对内皮细胞炎症影响的研究。本研究通过构建EZH2 的腺病毒载体转染HUVEC 及使用EZH2 特异性抑制剂GSK126 抑制HUVEC 中EZH2 转录激活，而建立EZH2 高表达和低表达的HUVEC炎症模型；结果显示，EZH2过表达可以促进ox-LDL 刺激HUVEC 分泌IL-6、TNF-α、IL-8、e-NOS 等炎症因子，抑制EZH2 表达则抑制ox-LDL 刺激HUVEC 分泌炎症因子，证实EZH2 具有促内皮细胞炎症的作用。但是本研究未对具体机制进行探讨，关于EZH2 通过何种机制促进内皮细胞炎症因子的产生尚不明确，EZH2是否在动物实验中有相同作用仍需进一步验证。本研究中，EZH2表达对于HUVEC 中IL-6、TNF-α、IL-8、e-NOS 表达均有影响，但是对CRP没有明显影响，考虑是由于CRP主要在肝细胞中产生，而不是由血管内皮细胞直接产生导致的。

综上所述，EZH2过表达可通过靶向调节炎症因子TNF-α、e-NOS、IL-8、IL-6 表达而引起内皮细胞炎症，从而参与AS形成，而抑制EZH2表达则具有相反作用。这提示EZH2在AS发生和发展中具有重要作用，EZH2 抑制剂的应用可能成为预防和治疗AS 的一种有效方法。