蓝萼香茶菜总二萜对实验性兔心肌缺血相关蛋白的影响∗

刘明洁

内蒙古民族大学，内蒙古 通辽028000

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一种高致死性疾病，通常由病理性冠状动脉闭塞引起［1］。急性心肌梗死（AMI）是冠心病的危险心脏事件［2］，通常由动脉粥样硬化斑块破裂或斑块侵蚀及随后的血栓形成造成部分或完全冠状动脉闭塞引起。溶栓、冠脉介入手术、冠脉搭桥术等是AMI再灌注的有效治疗方法［3-4］，有证据［5］显示再灌注后出现的损伤表现为心律失常、无复流现象、心肌顿抑及心肌细胞坏死等，于缺血前施用预处理以及其他干预措施，以保护心脏免受I/R 损伤，并且早期再灌注可能会降低缺血对心肌的损伤程度。

蓝萼香茶菜的茎、叶中主要含有蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丙素等。蓝萼香茶菜具有健胃、清热解毒、活血作用［6］。现代研究［7］发现全草对心血管有一定作用，蓝萼香茶菜还具有与剂量相关的心肌保护作用。蓝萼香茶菜二萜类化合物是蓝萼香茶菜的主要化学成分，研究表明其二萜类化合物之一蓝萼甲素具有保护心肌、改善微循环等作用，其乙醇提取液能减轻MI/RI，保护心肌［8］。临床研究［9］证实蓝萼香茶菜制剂治疗冠心病效果显著。本研究探讨TD预处理对实验性兔MI/RI动物模型相关蛋白的作用。

1 材料与方法

1.1 动物健康日本大耳白兔18 只，雄性，体质量2.5～3.0 kg，由沈阳药科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（辽）2009-0002。

1.2 药物与试剂实验药物TD 由解放军第202医院临床药理基地提供；肝素钠（上海三杰生物技术有限公司，批号：090201，规格：1 g/瓶）；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：6900183，规格：5 g/瓶）。

1.3 仪器MP100十六道生理仪（美国Stoelting公司）；JEM-1200EM透射电镜（日本电子株式会社）。

1.4 方法

1.4.1 MI/RI 动物模型的建立与分组［7］健康日本大耳白兔18 只，适应性喂养7 天后，随机分为3组，每组6只，假手术组（Sham组），缺血/再灌注组（I/R组），蓝萼香茶菜总二萜组（TD组）。术前7天Sham 组和I/R 组给予5 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，TD组灌胃TD［2.38 mg/（kg·d）］。各组于第7 天灌胃1 h 后于兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠30 mg/kg，麻醉后行气管插管及左颈总动脉插管，假手术组麻醉开胸后，于冠状动脉前降支（LAD）穿线，但不结扎线。I/R 组开胸后，于LAD 穿线并收紧结扎线，缺血40 min后松开结扎线并再灌注180 min，TD组处理同I/R组。

1.4.2 血清丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性检测 各组分别于再灌注180 min时采集动脉血，待测SOD活性和MDA含量。

1.4.3 心肌组织MDA、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和Caspase 3 活性检测 各组再灌注180 min 结束后，取缺血区心肌组织，严格按试剂盒说明书测定SOD、MDA、GSH-Px和Caspase 3的活性。

1.4.4 心肌组织病理学检查 实验结束后，取缺血心肌组织制作成光镜、电镜标本，观察并拍照。

1.4.5 Bcl-2 和Bax WB 法检测各组心肌细胞相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。

1.5 统计学方法采用SPSS 19 统计软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清SOD活性和MDA含量变化情况再灌注180 min 时，与Sham 组相比，I/R 组血清MDA 含量升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）。Sham组MDA 和SOD 与TD 组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与I/R 组比较，TD 组MDA 含量降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05）。见表1。

表1 3组兔血清MDA活性和SOD含量变化情况（±s）

表1 3组兔血清MDA活性和SOD含量变化情况（±s）

注：*表示与Sham 组比较，P＜0.05；#表示与I/R 组比较，P＜0.05

组别Sham组I/R组TD组兔数6 6 6 MDA（nmol/mL）1.98±0.62 6.48±2.99*2.05±0.69#SOD（U/mL）40.17±3.25 27.03±6.06*38.39±2.02#

2.2 光镜下兔心肌组织变化情况HE 染色显示：Sham 组兔心肌细胞结构正常，心肌纤维排列规则，组织间隙正常；I/R 组兔心肌纤维紊乱且有断裂；TD 组兔心肌纤维排列基本规则，间隙较正常稍宽。见图1。

图1 光镜下各组兔心肌组织结构（HE×400）

2.3 电镜下兔心肌组织变化情况电镜显示：Sham 组心肌细胞结构较完整，排列整齐，肌丝无明显改变，肌节清晰可见，Z 线清楚，线粒体形态正常，结构完整，线粒体整齐排列在肌原纤维之间，且方向与肌丝纵向一致，心肌细胞核呈长椭圆型，核仁清楚，核内染色质分布均匀。I/R 组心肌细胞水肿，肌膜破损，心肌纤维排列模糊，紊乱，部分肌丝断裂、溶解，Z 线不清，线粒体严重肿胀，嵴断裂，空泡化；TD 组心肌细胞结构损伤程度明显减轻，呈现好转趋势，心肌细胞轻度水肿，肌膜较完整，线粒体轻度肿胀，嵴较清楚结构较完整；与I/R组相比，TD组心肌电镜下结构明显好转。见图2。

图2 电镜下各组兔心肌组织结构（×5000）

2.4 心肌组织MDA含量、SOD、GSH-Px及Caspase 3活性变化情况再灌注180 min，与Sham 组比较，TD组、I/R组心肌组织中MDA含量、Caspase-3活性升高（P＜0.05），SOD和GSH-Px活力降低（P＜0.05）。与I/R组比较，TD组心肌组织中MDA含量、Caspase-3活性降低（P＜0.05），SOD 和GSH-Px 活力升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组兔心肌组织中MDA含量、SOD和GSH-Px活力变化情况（±s）

表2 各组兔心肌组织中MDA含量、SOD和GSH-Px活力变化情况（±s）

注：*表示与Sham组比较，P＜0.05；#表示与I/R组比较，P＜0.05

组别Sham组I/R组TD组兔数666 MDA（nmol/mg）0.97±0.19 3.91±1.10*1.15±0.22*#SOD（U/mg）80.56±15.67 47.50±10.23*75.52±11.63*#GSH-Px 22.35±4.32 9.09±2.55*19.70±6.63*#Caspase-3 14.73±4.06 65.61±13.49*20.52±3.66*#

2.5 心肌Bax 和Bcl-2 蛋白表达的比较与Sham 组相比，I/R 组Bcl-2 表达下降，Bax 表达增加（P＜0.05）；与I/R 组相比，TD 组Bcl-2 蛋白表达增加，Bax 表达降低（P＜0.05），表明TD 能上调Bcl-2表达，下调Bax表达，见图3。

图3 Western blot检测Bcl-2和Bax的表达

3 讨论

心肌缺血致心肌收缩功能减弱，且由于心肌细胞坏死和凋亡导致心肌损伤。MI/RI 是心脏手术后心功能受损的一个重要原因［10］。AMI 主要治疗目标是减少心肌损伤和心肌重构，增加心脏修复，通过血运重建迅速灌注梗死心肌，然而血运重建所致血管内皮损伤和炎症会导致心肌细胞功能障碍即MI/RI［11］。再灌注损伤包括再灌注引起的心肌细胞损伤、微血管损伤、心肌顿抑和再灌注心律失常，早期再灌注可减少心梗面积，但最终因再灌注引起室性心律失常可能是罕见的［12-13］。

氧自由基（ROS）是心肌缺血或再灌注损伤的重要发病机制之一。SOD歧化O2-为H2O2，GSH-Px虽不能直接清除ROS，但可清除H2O2和脂质过氧化物，抑制ROS 的生成反应。本研究结果显示，I/R组心肌SOD 和GSH-Px 活力降低，TD 组可升高心肌SOD 和GSH-Px 活力，说明TD 可提高心肌SOD 和GSH-Px活性。本研究结果显示：心肌缺血40 min，再灌注180 min 后，I/R 组心肌MDA 含量增加，SOD活性降低，说明MI/RI 后，脂质过氧化反应的产物增多，间接反映ROS 生成增加。TD 组SOD 活性升高，MDA 含量降低，提示TD 能抑制再灌注时ROS 增加而导致的脂质过氧化反应，增强心肌抗氧化能力，起到保护MI/RI的作用，且TD预处理对增强心肌抗氧化能力，减轻脂质过氧化损伤有明显作用，说明TD 能减少再灌注时氧自由基生成。TD 能降低血清MDA 并增加SOD，说明TD对再灌注时ROS 的减少起重要作用。

心肌细胞凋亡已被确认为MI/RI 中的一个重要机制［14］，因此，抑制心肌细胞凋亡可减轻I/R 损伤。MI/RI 时，心肌石蜡切片HE 染色后光镜下结构显示：I/R 组心肌细胞排列紊乱，部分区域心肌纤维断裂。电镜下显示超微结构明显受损，主要表现为I/R 组肌膜破损，心肌纤维排列模糊、紊乱，部分肌丝断裂、溶解，Z 线不清，线粒体嵴断裂，空泡化形成。TD 组心肌损伤程度明显减轻，提示TD 预处理能明显减轻心肌组织损伤，对心肌有保护作用。本研究结果表明MI/RI激活Caspase 3并上调Bax，而TD 可抑制Bax 和Caspase 3 的产生。Caspase 3 是凋亡级联中“效应”蛋白酶关键作用点，在细胞凋亡的死亡受体和内在线粒体通路中起重要作用。Bcl-2 是位于线粒体外膜和内质网上的抗凋亡蛋白，Bcl-2 过表达可减少心肌细胞凋亡和缺血/再灌注损伤的心梗面积［15］。

I/R 诱导心肌细胞损伤的发病机制有多种因素。本研究结果显示，TD 可以增加抗凋亡蛋白Bcl-2，抑制促凋亡蛋白Bax的表达，还可抑制ROS产生，能增加心肌组织的抗氧化能力，提示该药对心肌细胞有保护作用。