温肾强骨丸对脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠骨转化指标的影响∗

邓 强，王雨榕，李中锋，彭冉东，李军杰，徐浩军

1 甘肃省中医院脊柱骨二科,甘肃 兰州730050；2 甘肃中医药大学

骨质疏松症是目前老年人群主要罹患的疾病之一，西医学治疗方法较为单一，临床研究发现，中医药防治骨质疏松症具有独特优势，本病属中医学“骨痿”“骨枯”等范畴，主要与肾、肝、脾3 脏功能有关，其中肾精亏虚是发病的基本病机，近年多数医家从温补脾肾入手治疗本病取得了良好疗效。骨质疏松症和脾肾阳虚中医证型造模方法种类多样，骨质疏松症造模方法主要包括去势型、药物诱导型、失用诱导型、饮食诱导型、基因敲除型、自然退变型等［1］，其中去势型造模方法具有模型稳定、可操作性强、可信度高，经济适用等特点，应用广泛。肾阳虚造模方法有注射氢化可的松、灌胃腺嘌呤、切除性腺等［2］；脾阳虚造模方法主要包括番泻叶/大黄灌胃、饮食失节、劳倦过度等。根据其病因病机，采用番泻叶灌胃+饮食失节+劳倦过度方法联合造模可更好模拟人类脾肾阳虚发病机制。本研究通过建立脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠模型，观察各组大鼠骨转化指标变化情况，进一步探讨温肾强骨丸防治脾肾阳虚型骨质疏松症的作用机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 大鼠70 只，雌性，体质量（220±20）g，购自甘肃中医药大学SPF 级实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2015-0005。实验动物喂养于甘肃中医药大学动物实验中心（SPF 级），普通大鼠颗粒饲料喂养，饮用水为高压灭菌自来水。环境温度4～18℃，光照时间7∶OO AM～7∶OO PM，暗室时间7∶OO PM～7∶OO AM，空气湿度45%～65%。

1.2 试剂与药品抗酒石酸碱性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-0620R2）；大鼠尿Ⅰ型胶原交联N 末端肽（type I collagen cross linked N telopeptides in urine，U-NTX）试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-1056R2）；骨碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，BLAP）试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-0619R2）；雌二醇（estradiol，E2）试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-0575R2）；尿型胶原交联C 末端肽（C-terminal telopeptides of type I collagen，U-CTX)、试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-1037R2）；骨钙蛋白（osteocalcin，BGP)试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：MM-0700R1）；氢化可的松注射液（紫光古汉集团衡阳制药有限公司，国药准字H43021210，规格：2 mL∶10 mg）；番泻叶（购自甘肃省中医院中药药房）；温肾强骨丸（甘肃省中医院，批号：20180926，规格：40 g/瓶）；阿仑膦酸钠（杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20130085，规格：70 mg/片）；甘蓝、精炼猪油自备，蒸馏水、生理盐水、10%水合氯醛、10%甲醛溶液、苦味酸等由甘肃中医药大学实验中心提供。番泻叶为100%水煎液。

1.3 仪器L600 型台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Benchmark aaPlus 型连续波长酶标仪（美国BIO-RAD 公司）；Q5000型紫外分光光度计（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；DK-S26 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；NW10VF 型超纯水系统（力康生物医疗科技控股有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模 将大鼠适应性饲养后随机分为正常组、假手术组、模型组、西药组（阿仑膦酸钠）及温肾强骨丸高、中、低剂量组，除正常组外，其余各组大鼠采取去势法（切除雌性SD 大鼠双侧卵巢）+注射氢化可的松+番泻叶灌胃+饮食失节+劳倦过度方法造模：大鼠禁食12 h 后腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），麻醉起效后剔除两侧腹部皮毛，用75%酒精消毒，在双侧肋下1～1.5cm处纵形切开入腹，结扎双侧卵巢动脉，切除双侧卵巢及周围脂肪，逐层缝合［3］。假手术组只暴露双侧卵巢，不做切除。去势术后第2天开始，每日上午9时用100%番泻叶水煎液灌胃，每只2 mL，正常组与假手术组灌胃等量生理盐水；每日下午3 时将大鼠置于38℃恒温水浴中游泳至疲劳（疲劳标准为全身下沉至没颈，不能坚持游泳）；单日喂饲甘蓝每只10 g，双日喂精炼猪脂每只2 mL，正常组与假手术组予普通鼠粮，期间各组均自由饮水［4］，大鼠术后1周开始肌肉注射氢化可的松注射液（2 mL∶10 mg）5 mg/kg，假手术组肌肉注射等量生理盐水，每周4次。

1.4.2 干预方法 造模8 周，确定骨质疏松动物模型成功后温肾强骨丸高、中、低剂量组按人、鼠体型系数折算为成人等效剂量（生药含量分别为1.72、0.86、0.43 g/kg，并以每千克体质量20 mL蒸馏水稀释，制成混悬液灌胃），每日1 次；正常组和模型组灌胃等剂量生理盐水；西药组按人鼠等效剂量给予阿仑膦酸6 mg/kg，每周1次，持续灌胃8周。

1.5 血清骨转化指标测量所有动物干预8 周后禁食水12 h，腹腔麻醉后心脏取血4 mL，严格按照试剂盒说明书运用酶联免疫吸附法检测TRAP、U-NTX、BLAP、E2、U-CTX、BGP 等骨转化指标，其质量浓度按说明制作各自标准曲线，计算样品中的含量。

1.6 统计学方法采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般活动造模期间，第1～3 周各组大鼠一般状态比较基本无差异；第4 周，模型组大鼠活动较正常组及假手术组减少，开始出现毛发无泽、掉毛现象，爪甲颜色较浅，大便较稀软；第5 周，模型组大鼠出现大便清稀，甚者如水状，爪甲颜色变淡，毛发枯萎无华，尾巴凉，弓背倦怠，喜扎堆；第6～8周，模型组大鼠上述状态较第5周更甚，且饮食、饮水量低于空白组，游泳持续时间为正常组的1/2，表明模型组大鼠体力、能量代谢较正常大鼠组及假手术组大鼠降低。温肾强骨丸干预后第1～2 周，与模型组相比，温肾强骨丸各剂量组大鼠一般情况基本无明显差异；第3～4 周，温肾强骨丸各剂量组大鼠活动较模型组明显增多，掉毛明显减少，扎堆现象有所改善，大便仍清稀；第4～6周，温肾强骨丸各剂量组大鼠无扎堆现象，毛发色泽明显改善，尾巴温度恢复正常，大便稀软但成形，大便量较多；第7～8 周，与模型组相比，温肾强骨丸各剂量组大鼠大便质地恢复，无便溏症状，饮食、饮水量恢复正常，活动明显增多，脾肾阳虚症状明显改善。

2.2 骨代谢指标与正常组和假手术组比较，模型组大鼠BALP、E2含量降低（P＜0.05），BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿仑膦酸钠组和温肾强骨丸各剂量组BALP、E2含量均增高（P＜0.05）；BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX 含量均下降（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠骨代谢指标比较（±s）

表1 各组大鼠骨代谢指标比较（±s）

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与温肾强骨丸低剂量组比较，P＜0.05

组别正常组模型组假手术组温肾强骨丸高剂量组温肾强骨丸中剂量组温肾强骨丸低剂量组阿仑膦酸钠组鼠数8 8 8 8 8 8 8 BGP（ng/L）194.59±14.91 231.50±40.25*168.68±17.06 179.42±19.27#△186.69±21.38#181.46±16.20#173.63±31.48#TRAP（pg/mL）625.07±158.43 933.72±53.09*703.40±244.26 828.38±58.16#△830.61±52.49#819.60±52.49#824.28±62.89#U-NTX（nmol/L）3.95±0.56 4.86±0.71*4.31±0.95 3.71±0.88#△4.40±1.82#3.97±1.44#3.90±0.89#U-CTX（µg/L）0.28±0.62 0.41±0.22*0.34±0.20 0.34±0.20#△0.40±0.10#0.32±0.20#0.39±0.70#BALP（µg/L）4.02±2.91 1.91±1.41*3.53±2.57 2.40±1.52#△2.51±1.34#2.90±0.49#2.10±0.54#E2（ng/L）19.61±0.52 16.72±1.78*17.57±2.97 21.32±1.19#△19.90±1.82#17.31±1.39#25.19±1.95#

3 讨论

骨质疏松症的治疗临床常用药物主要有抗骨吸收药物和促骨形成药物两类，但由于长期用药副作用较大、患者经济压力大等缺点，使得中医药治疗骨质疏松症的独特优势成为研究热点［5-6］。近年来，随着分子生物学的发展，从基因调控水平证实中医药治疗骨质疏松症的作用机制，为中医药靶向治疗提供了科学依据。

中医藏象理论认为，肾“主骨生髓”，主人体生长发育，为“先天之本”，受“后天之本”脾脏运化的水谷精微充养，因此人体骨骼的生长发育与脾肾密切相关，且在骨质疏松症的中医证型研究中，有学者发现脾肾阳虚证是骨质疏松症的主要证型［7］。临床研究证实补肾健脾方药治疗脾肾阳虚型骨质疏松症有显著疗效，如潘永苗等［8］用补肾健脾通络汤治疗骨质疏松症，发现其能提高患者骨密度，减轻患者症状。王岩等［9］在口服钙尔奇（碳酸钙D3）片、罗钙全（骨化三醇丸）的基础上加用补肾健脾益气方（茯苓9 g，白术9 g，陈皮9 g，人参6 g，生地黄6 g，枸杞子30 g，麦门冬15 g）治疗脾肾气虚型老年骨质疏松症取得了良好疗效。黄琳玲等［10］采用自拟益肾健脾化瘀方治疗绝经后脾肾阳虚型骨质疏松症，发现该方可改善临床症状，提高患者骨密度。

BALP 是成骨细胞的一种细胞外酶，BALP 的增殖、分化和成熟与骨骼正常生长发育密切相关，骨骼矿化受阻时，成骨细胞合成大量碱性磷酸酶，使血清BALP 明显升高。骨特异性碱性磷酸酶参与骨形成过程，在血清中稳定，是成骨细胞成熟和具有活性的标志［11］。BALP 被认为是最精确的骨形成标志物之一。血清BALP 定量测定与动态观察对骨代谢疾病，特别是骨质疏松症的早期诊断、治疗效果监测、病情预后判断等提供有效依据。BGP是反映骨形成的特异性生化指标，不仅参与骨吸收调节，更重要的是参与基质矿化过程及成骨细胞分化，与骨转换相关，能维持骨正常矿化速率，抑制软骨矿化速率，并抑制骨异常羟磷灰石结晶形成［12］。因此，BGP 通常被认为是反映骨形成的生化指标。TRAP 作为第2 代骨吸收标志物，是有特异和高敏感度的骨吸收指标［13］。在骨的有机质中，90%为Ⅰ型胶原，NTX 与CTXI 水平均能反映破骨细胞骨吸收活性［14］，是骨吸收的重要生化标志物［15］，其升高程度与破骨细胞活性增高程度一致，可灵敏反映骨代谢变化，是评价骨形态计量学骨吸收的重要参数［16］。研究［17］发现，NTX与CTX 是骨代谢的敏感指标，与骨密度改变、骨折发生具有相关性，其增加可提示骨关节炎患者骨量减少。

温肾强骨丸是甘肃省中医院脊柱骨二科经验方药，由淫羊藿、骨碎补、枸杞子和丹参等7 味中药组成，具有温肾强骨、活血通络功效，临床用于治疗脾肾阳虚型骨质疏松症取得良好效果，因此，本实验基于临床疗效观察研究其对脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠的防治作用，为临床广泛运用提供实验依据。本实验采取去势（切除大鼠卵巢）+注射氢化可的松+番泻叶灌胃+饮食失节+劳倦过度方法制造脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠模型，病症相结合，更好地模拟人类发病机制，结果显示，模型组大鼠BALP、E2含量降低，BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量升高；与模型组相比，阿仑膦酸钠组和温肾强骨丸方各组BALP、E2均增高，BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量均下降。

综上所述，温肾强骨丸改善了脾肾阳虚型骨质疏松大鼠的骨代谢生化指标，表明温肾强骨丸对脾肾阳虚型骨质疏松有一定防治作用，但是其药动学仍需进一步研究，并且其作用机制不明确，未来可基于骨质疏松症发生的信号通路进一步深入研究其对骨代谢影响的作用机制，为温肾强骨丸的广泛临床应用提供研究基础。