鸦胆子苦醇对人非小细胞肺癌H1299 细胞辐射增敏作用研究∗

张 芳，杨蓉佳，付朝霞

1 华池县人民医院，甘肃 华池745600；2 甘肃省人民医院

从天然产物中筛选辐射增敏药物成为癌症放射治疗研究的热点［1］。近年来，一种源于苦木科植物鸦胆子种子的活性提取物——鸦胆子苦醇（brusatol，BRU）逐渐进入了研究人员的视野，因为BRU 能够抑制核转录因子2（nuclear transcription 2，Nrf2）的表达，产生抗肿瘤和抗氧化应激等作用［2］。肿瘤细胞通过Nrf2途径产生辐射耐受性是目前癌症放疗的棘手问题，而BRU 对Nrf2 具有抑制作用，无疑为癌症的放疗以及辐射联合药物治疗研究提供了新契机，国内学者首次证实BRU可通过抑制Nrf2 而增加肿瘤细胞的辐射敏感性，是一种潜在天然增敏药物［3］。然而BRU 联合辐射通过何种途径抑制Nrf2 表达，进而诱导肿瘤细胞凋亡至今尚未阐明。本研究探讨BRU抑制Nrf2以及增加非小细胞肺癌H1299细胞辐射敏感性的可能途径，揭示BRU联合辐射诱导H1299细胞凋亡的内在机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器二甲基亚砜（dimethyl

sulfoxide，DMSO，批号：08371）、BRU 和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批号：C0065，美国Sigma 公司提供）；细胞增殖检测试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8，批号：C0038）、细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI，批号：C1062S）和胞内活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，批号：S0033S，碧云天公司提供）；PI3K（Tyr458，批号：4292）、PI3K（Tyr458，批号：17366）、Akt（Ser473，批号：9272）、Akt（Ser473，批号：4060）、p70S6K（Thr389，批号：9202）、p70S6K（Thr389，批号：97596）由美国Cell signal 公司提供；其他抗体（美国Abcam 公司）；DMEM培养基和胎牛血清（美国Gibco公司），其他试剂均由国内公司提供。流式细胞仪（德国默克密理博公司）；凝胶成像系统（美国Protein sample 公司）；酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；电泳仪、电泳槽（美国Biorad公司）；激光共聚焦显微镜（德国Zessi公司）。

1.2 细胞人非小细胞肺癌H1299 细胞在含10%胎牛血清DMEM 培养液中，在37℃、含5%CO2培养箱中培养，细胞生长密度达到80%时传代，取对数期细胞开展实验。

1.3 实验方法

1.3.1 CCK-8 法检测细胞活性 调整H1299 细胞密度为1.5×104个/孔，接种于96孔板。培养24 h后，加入经培养液稀释的不同浓度BRU，继续培养2、6、12、24、48 h，收样。设定酶标仪吸光值为450 nm，测定各孔吸光值（A），根据细胞增殖抑制实验得出BRU的IC50，根据公式计算抑制率。

抑制率（%）=［A450（阴性）-A450（给药）］/［A450（阴性）-A450（空白）］×100%

1.3.2 BRU 抑制Nrf2 表达的最佳作用时间 用IC50的BRU 处理H1299 细胞2、4、6、12、24、48 h 后，收集细胞，提取全蛋白，定量、变性后用12% SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白质，经转膜、封闭、一抗4℃过夜和二抗孵育，用化学发光法显色，用凝胶成像系统拍照记录，分析灰度值。

1.3.3 辐射增敏实验 将细胞分为对照组、BRU组（IC50）、X 射线组（2 Gy）和BRU 联合X 射线组（BRU+2 Gy）。其中BRU组和BRU+2 Gy组用100 nmol/L（IC50）的BRU 预处理24 h。调整H1299 细胞密度为5×104个/mL，接种于6孔板，细胞经100 nmol/L的BRU 预处理24 h，采用医用直线加速器提供的X 射线一次性照射细胞，剂量均为1 Gy/min，室温条件下照射剂量为2 Gy，照射24 h后收细胞样。

1.3.4 胞内活性氧实验 调整细胞密度为1×105个/mL，将细胞重悬浮于含有10µmol/LDCFH-DA的无血清培养基中，37°C孵育20 min，再用无血清培养基洗3 次，经流式细胞仪检测细胞荧光强度，平均荧光强度值（mean fluorescence intensity，MFI）代表ROS含量。

1.3.5 细胞凋亡实验 调整细胞密度为1×105个/mL，将细胞重悬浮于预冷的结合缓冲液，加入5 µL Annexin V-FITC 和5 µL PI 轻轻混匀后室温避光孵育15 min，经流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.6 平板克隆形成实验 以每孔200 个细胞密度接种于6 孔板，同时设无药对照组，每组3 个重复，在37°C、5%CO2条件下持续培养14 天。经洗涤、甲醇固定、吉姆萨（Giemsa）染色后，晾干、拍照，计算肉眼可见的集落数。

克隆形成率（%）=（克隆集落数/接种细胞数）×100%

1.3.7 蛋白表达分析 细胞经处理后用蛋白裂解液提取总蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，用10%和12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并经转膜、封闭、孵一抗和二抗后，用化学发光法检测蛋白条带，最后用Protein sample 凝胶成像仪拍照并计算蛋白灰度值。

1.3.8 Nrf2 蛋白免疫荧光定位 将每组经细胞爬片处理的盖玻片用PBS 清洗3 次，用0.2%的Triton X-100 透化细胞10 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，用5%的BSA 封闭细胞30 min，经一抗4℃过夜和荧光二抗孵育。用终浓度为0.5µg/mL 的DAPI染色10 min，PBS清洗3 次，将盖玻片置于载玻片，用抗淬灭封片剂封片，用激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.4 统计学方法用SPSS 19.0软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRU对H1299细胞和Nrf2表达的抑制作用从6 h开始细胞生长呈时间和剂量依赖性被抑制，在12、24 和48 h 的IC50值 分 别 是350.2、102.4 和100.9 nmol/L，表明100 nmol/L左右的BRU可以显著抑制H1299 细胞增殖，因此选用该浓度作为研究浓度。100 nmol/L的BRU作用H1299细胞6、12、24和48 h后，Nrf2表达不具有时间依赖性，BRU处理后24 h，Nrf2 的表达最低，因此，选取24 h 作为以下研究的时间点。见图1。

图1 BRU对H1299细胞和Nrf2表达的抑制作用

2.2 各组H1299 细胞克隆存活能力与对照组相比，BRU 组（P＜0.05）、2 Gy 组（P＜0.01）和BRU+2 Gy组（P＜0.001）H1299细胞的克隆形成率降低；与2 Gy 组相比，BRU+2 Gy 组细胞形成率差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图2 各组H1299细胞克隆存活能力

2.3 各组H1299 细胞凋亡情况与对照组相比，BRU 组（P＜0.01）、2 Gy 组（P＜0.001）和BRU+2 Gy组（P＜0.001）细胞凋亡率升高；2 Gy 与BRU+2 Gy组细胞凋亡率比较差异有统计学意义（P＜0.001）。见图3。凋亡率（%）=（R4+R5）/R1×100%，R1=1000。

2.4 各组H1299细胞胞内ROS情况与对照组相比，BRU 组（P＜0.05）、2 Gy 组（P＜0.05）和BRU+2 Gy 组（P＜0.01）MFI 升高；2 Gy 组与BRU+2 Gy 组MFI比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 各组H1299细胞胞内ROS含量及H1299细胞凋亡率

2.5 BRU 联合X 射线抑制H1299 细胞PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路与对照组相比，BRU组（p-PI3K，P＜0.05；p-Akt，P＜0.01；p-p70S6K，P＜0.05）、2 Gy组（P＜0.01）和BRU+2 Gy 组（P＜0.001）的磷酸化PI3K、Akt 和p70S6K 水平降低（图4B）；BRU 组Nrf2（P＜0.001）、HO-1（P＜0.001）和NQO-1 表达降低（图4D）；BRU+2 Gy组Nrf2（P＜0.001）、HO-1（P＜0.01）和NQO-1（P＜0.01）表达降低（图4D）；2 Gy组Nrf2、HO-1 和NQO-1 表达升高（图4D），说明2 Gy 剂量的X 射线照射会使H1299 细胞Nrf2 表达升高，产生抗氧化应激作用；BRU 组和BRU+2 Gy 组细胞核中Nrf2 的核位移程度减弱（图5），2 Gy 组细胞核中Nrf2的核位移程度增强（图5）；2 Gy组与BRU+2 Gy组磷酸化PI3K（P＜0.05）和Akt（P＜0.05）水平比较差异具有统计学意义（图4B），Nrf2（P＜0.001）、Keap1（P＜0.05）、HO-1（P＜0.01）和NQO-1（P＜0.01）的表达降低。

图4 各组H1299细胞PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达情况

图5 各组H1299细胞线粒体凋亡情况

2.6 各组H1299 细胞线粒体凋亡情况与对照组相比，BRU组（P＜0.05）、2 Gy组（P＜0.05）和BRU+2 Gy 组Apaf-1（BRU 组P＜0.01；2 Gy 组P＜0.01；BRU+2 Gy组P＜0.001）、bax/bcl-2（BRU组P＜0.01；2 Gy组P＜0.01；BRU+2 Gy组P＜0.01）、cytochrome C（BRU 组P＜0.05；2 Gy 组P＜0.01；BRU+2 Gy 组P＜0.001）和cleaved-caspase 3的表达升高（BRU组P＜0.05；2 Gy组P＜0.05；BRU+2 Gy组P＜0.001）（图6B）；2 Gy 组与BRU+2 Gy 组Apaf-1（P＜0.05）、bax/bcl-2（P＜0.05）和cleaved-caspase 3（P＜0.001）比较差异有统计学意义。见图6。

图6 各组线粒体凋亡通路蛋白表达情况

3 讨论

从中医药提取的天然产物在抑制肿瘤方面具有独特优势，因此，从天然产物对肿瘤细胞的作用机制入手，探讨天然产物联合放疗对肿瘤组织的作用方式和途径，对促进中医药发展具有重要意义［4］。有研究［5］表明，BRU能够通过抑制Nrf2表达有效抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，是具开发价值的天然抗肿瘤药物之一。有研究［6］发现，辐射可以抑制PI3K/Akt/Nrf2 信号通路，诱导肿瘤细胞ROS 含量升高，诱导肿瘤细胞凋亡，这对理清BRU通过抑制Nrf2增加肿瘤细胞辐射敏感性研究提供了思路。本研究以p53 缺失具有辐射耐受性的人非小细胞肺癌H1299 细胞为研究对象，从PI3K/Akt/Nrf2信号通路出发探讨BRU的辐射增敏作用，揭示其内在分子机制。

本研究结果表明，BRU 对H1299 细胞生长和Nrf2 蛋白表达具有抑制作用。BRU 对H1299 细胞生长的抑制作用具有时间和剂量依赖性，经IC50处理的H1299 细胞，Nrf2 表达呈时间依赖性。表明BRU可通过抑制Nrf2表达从而抑制细胞增殖，y该结果与文献报道一致［7-8］。BRU 或X 射线都能抑制H1299 细胞增殖、促进凋亡，研究结果与文献报告一致［3］。而BRU联合X射线能够更好抑制H1299细胞增殖、促进凋亡，提示BRU 可增强H1299 细胞辐射敏感性，进而提高放疗疗效。

Nrf2 是一个转录因子，在控制氧化反应中发挥关键作用，对抑制炎症反应和细胞蛋白酶以及维持线粒体功能具有重要作用［9］。正常状况下，只有小部分Nrf2 进入细胞核启动转录，大部分Nrf2 与Keap1 结合形成复合物，便于被泛素蛋白酶体降解［10-11］。Nrf2被认为是重要的细胞保护因子之一，肿瘤细胞Nrf2 的异常激活，与癌症的药物治疗和辐射耐受性有关，目前研究人员还未就Nrf2 的调控机制达成一致［12］。有研究［13］发现，PI3K/Akt 信号通路是肿瘤细胞重要的存活通路，该通路的激活能够增加肿瘤细胞蛋白合成，参与调节细胞增殖、迁移、凋亡等过程，PI3K/Akt 信号通路已被证实与多种癌症的发生、转移、恶化等过程相关。相关研究［14］证实Nrf2是Akt的靶蛋白之一，Akt 或其上游PI3K 被抑制均可抑制Nrf2 活性，这为揭示BRU 辐射增敏作用的内在分子机制提供了契机。

本研究结果表明，BRU 能抑制PI3K 和Akt 磷酸化水平，降低Nrf2 及其下游蛋白表达，在2 Gy组和BRU+2 Gy 组都能观察到相似结果，表明BRU可通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制Nrf2活性，增加H1299 细胞的辐射敏感性。Nrf2 表达降低使H1299细胞抗氧化能力减弱，一方面使ROS含量升高，诱发DNA 损伤应答，激活ROS 下游凋亡信号通路，诱导细胞凋亡［15］，本研究中BRU 组、BRU+2 Gy组和BRU+2 Gy 组高ROS 含量和细胞凋亡率能够证明这一过程；另一方面，Nrf2 活表达降低能够减少其靶蛋白Bcl-2表达，导致Bax/Bcl-2比例失衡，激活Apaf-1，释放细胞色素c，活化Caspase-3，激活线粒体凋亡通路［16］，导致H1299 细胞凋亡，本研究中线粒体凋亡途径的Western blotting 结果能够证明这一过程。

综上所述，BRU 通过抑制PI3K/Akt/Nrf2 信号通路增强H1299细胞的辐射敏感性，该结果为BRU的辐射增敏作用机制研究提供了依据。