4个鸡品种胚胎发育后期肌纤维组织学特性比较分析

谷 爽，文超良，李俊英，吴桂琴，李光奇，韩文朋，闫奕源，孙从佼，杨 宁*

（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.北京市华都峪口禽业有限责任公司，北京 101206）

鸡肉品质主要表现为外在表观品质和内在食用品质，内在食用品质由肌纤维物理和生化特性决定。肌纤维组织学特性包括肌纤维总数、肌纤维直径、肌纤维面积和肌纤维密度等指标[1]。目前普遍认为骨骼肌肌纤维总数在胚胎期已固定，出雏后数量无变化[1]，而出雏后肌肉生长较大程度上由胚胎期形成的肌纤维总数决定[2]。因此，胚胎期肌纤维发育状态对肌肉产量与质量至关重要，研究胚胎期肌纤维发育对于改善鸡肌肉品质意义重大。Miraglia和Yalcin等研究发现，与慢速生长型鸡相比，快速生长型鸡拥有更多肌纤维数量、更大肌纤维面积和更小肌纤维密度[3-4]。对生长性状高强度持续选育可能导致快速生长型鸡在胚胎期形成更多肌纤维，出雏后通过肌纤维增生和肥大得到相对更大的肌纤维总面积，加速肌肉生长。

我国拥有极丰富鸡种质资源，主要分为：蛋鸡、肉鸡和兼用地方品种鸡等。蛋鸡品种产蛋性能优良，但早期生长速度缓慢，常见高产蛋鸡包括白来航鸡和洛岛红鸡。肉鸡品种生长速度快，尤其是快大型白羽肉鸡，其活重在6周龄可达到2.5 kg。地方品种鸡大多为肉蛋兼用型，肉质鲜美，长速介于蛋鸡和肉鸡之间，如北京油鸡、茶花鸡等。本研究从胚龄、组织、品种和性别4个因素出发，探究蛋鸡、地方鸡种和肉鸡在胚胎后期肌纤维组织学发育差异，以期深入理解不同生长速度鸡种在胚胎后期肌纤维发育特性，为提高鸡肉产量与质量探索新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

试验所用白来航鸡和北京油鸡合格种蛋来源于中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地；白洛克鸡和科尼什鸡种蛋由北京市华都峪口禽业有限责任公司提供。白来航鸡生长速度缓慢，为常见高产蛋鸡；北京油鸡遗传性能稳定，是我国珍贵地方鸡种；科尼什鸡和白洛克鸡分别为快大型白羽肉鸡父系和母系，生长速度快，6周龄体重均可达2.5 kg以上。

种蛋入孵前，用新洁尔灭消毒液清洁和消毒种蛋。种蛋孵化期间，温度保持（37.8±0.1）℃，相对湿度60%，翻蛋时长60 s，翻蛋间隔90 min。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

白来航鸡、北京油鸡、白洛克鸡和科尼什鸡种蛋孵化至ED15、ED17及出雏时，分别选择鸡胚重量相近公母鸡胚各2只，采集左侧完整胸大肌和腿肌，保存在装有4%多聚甲醛的10 mL离心管中，用于后续石蜡切片制作。同时，采集鸡胚皮肤组织暂存于-20℃冰箱用于后续性别鉴定。

1.2.2 鸡胚性别鉴定

取出暂存于-20℃冰箱的鸡胚皮肤组织，按照TransDirect Animal Tissue PCR Kit（AD201-01,北京全式金生物技术有限公司）操作步骤利用CHD1基因作PCR扩增鉴定性别，扩增反应体系：AD1Buffer、AD2 Buffer、AD3 Buffer混合液2μL，上游引物（10μmol·L-1）0.2μL，下游引物（10μmol·L-1）0.2μL，2×TransDirect PCR SuperMix 5μL，Nuclearfree water 2.6μL，总体积10μL。待反应结束后取9μL扩增产物点样于1%琼脂糖凝胶，140 V条件下跑胶10 min，最后使用凝胶成像系统（SmartGel 140，北京赛智创业科技有限公司）检测结果。如图1所示，1个条带个体为公胚，2个条带个体为母胚[5]。

图1 电泳检测Fig.1 Electrophoresis results

1.2.3 石蜡切片制作和染色

将采集的肌肉组织样品置于4%多聚甲醛中固定48 h以上，垂直肌纤维方向修整肌肉获得横截面，依次经20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%各级乙醇溶液脱水，随后包埋石蜡、切片、捞片、烤片，最后采用苏木素-伊红染色（HE染色）。

1.3 肌纤维组织学特性测定

利用全自动数字病理切片扫描仪扫描切片，扫描完成后随机选取至少8个部位放大至40×后输出图像。利用Image-J和Image-Pro Plus（6.0）软件统计肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维面积占比和肌纤维密度共4个指标。

测定各输出图像中单个肌纤维直径和肌纤维面积，将单个样本8个部位图像的平均值代表个体肌纤维直径和肌纤维面积；视野内肌纤维总面积与输出图像总面积比值平均值为肌纤维面积占比；视野内肌纤维根数与该输出图像总面积比值平均值为肌纤维密度。

1.4 数据分析与处理

将上述测定结果导入SPSS 25.0软件，采用一般线性模型（General linear model,GLM）对肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维面积占比、肌纤维密度在品种、性别、组织、胚龄间作最小二乘分析；利用单因素方差分析（ANOVA）不同维度作差异分析，结果以平均值±标准误（mean±SEM）表示。

2 结果与分析

2.1 品种、胚龄、性别、组织部位对肌纤维组织特性的效应分析

对肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维面积占比和肌纤维密度在品种、性别、组织、胚龄间作最小二乘分析，4个因素主效应及交互效应如表1所示。

表1 各因素主效应及交互效应分析Table 1 Analysisof main effects and interaction effects of four factors

由性别为主效应及性别与其他因素交互效应分析可知，肌纤维直径、面积、面积占比、密度均不受性别影响。品种、组织和胚龄3个因素对肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维密度主效应影响极显著（P＜0.01），两两之间交互效应对肌纤维面积和肌纤维面积占比影响显著（P＜0.05），3个因素交互效应对肌纤维组织学特性4个指标影响显著（P＜0.05）。

2.2 胚胎后期肌纤维组织学形态比较分析

4个品种鸡在胚胎后期肌纤维发育规律一致，以科尼什鸡胸肌和腿肌在胚胎后期肌纤维组织学形态为例（见图2），ED15时胸肌和腿肌肌纤维轮廓尚不清晰，ED17时肌纤维轮廓较为清晰，肌纤维初步形成。ED17至出雏这一时期，单根肌纤维开始增大，D1时肌纤维清晰可见。

ED17为肌纤维发育分界点，鸡胚在此之前完成单核成肌细胞融合，形成多核肌纤维，此后开始肌纤维增大。由图2B～C和E～F的肌纤维形态学图可见，胸肌和腿肌在胚胎后期肌纤维发育速度略不同，相同放大倍数下，鸡胚从ED17发育至D1，胸肌肌纤维面积变化较小。

图2 科尼什鸡ED15、ED17和D1胸肌和腿肌肌纤维横切面图（40×）Fig.2 Cross-sectional view of the pectoralis and leg musclefibersof Cornish in ED15,ED17 and D1（40×）

2.3 胸肌和腿肌在胚胎后期肌纤维发育差异

图3（A～D）分别为白来航鸡、北京油鸡、白洛克鸡和科尼什鸡在胚胎后期胸肌和腿肌肌纤维组织学特性差异分析结果。从发育阶段看，白来航鸡、北京油鸡和白洛克鸡胸肌自ED17发育至D1，其肌纤维直径和肌纤维面积未出现显著变化（P＞0.05），而科尼什鸡（见图3D）胸肌肌纤维组织特性在ED17和D1两个时间点表现显著差异。科尼什鸡胸肌肌纤维直径和面积在D1显著大于ED17（P＜0.05），肌纤维面积占比和肌纤维密度在ED17极显著大于D1（P＜0.01）。4个品种鸡腿肌肌纤维组织学特性在ED17和D1时表现一致，肌纤维直径、面积和密度在两个时间点均差异极显著（P＜0.01），而肌纤维面积占比差异不显著（P＞0.05）。

从组织部位看，鸡胚发育至ED17时，白来航鸡（见图3A）与北京油鸡（见图3B）胸肌和腿肌的肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维密度均未出现显著差异（P＜0.05），而两个肉鸡品种鸡（见图3C～D）胸肌和腿肌已出现差异，表现为腿肌肌纤维极显著大于胸肌（P＜0.01），胸肌肌纤维密度极显著高于腿肌（P＜0.01）。此后腿肌肌纤维比胸肌发育快，D1时4个品种鸡胸肌和腿肌肌纤维组织学特性均表现出显著差异（P＜0.05），胸肌肌纤维密度仍极显著高于腿肌（P＜0.01）。

图3 4个鸡品种胚胎后期胸肌和腿肌肌纤维组织特性Fig.3 Histological characteristics of the musclefibers of the pectoralis and leg muscles during the late embryonic period among four breeds of chickens

2.4 不同品种在胚胎后期肌纤维发育差异

胸肌肌纤维由ED17发育至D1，其形态学差异较小，因此本研究将ED17时胸肌肌纤维组织形态学在4个品种间差异作对比分析。由表2可知，白来航鸡和北京油鸡肌纤维直径和面积比白洛克鸡和科尼什鸡大，但肌纤维直径差异不显著（P＞0.05），肌纤维面积差异显著（P＜0.05），而白来航鸡和北京油鸡肌纤维密度显著低于白洛克鸡和科尼什鸡（P＜0.05）；白来航鸡和北京油鸡肌纤维面积和肌纤维密度差异不显著（P＞0.05），白洛克鸡和科尼什鸡肌纤维面积和肌纤维密度差异不显著（P＞0.05）。

腿肌肌纤维在胚胎后期增加较快，本研究将D1时腿肌肌纤维形态学在4个品种间差异作对比分析。由表2可知，D1时腿肌肌纤维密度，白洛克鸡和科尼什鸡显著高于白来航鸡和北京油鸡（P＜0.05），且白来航鸡和北京油鸡之间、白洛克鸡和科尼什鸡之间差异均不显著（P＞0.05）。

表2 4个鸡品种胚胎后期肌纤维组织特性统计Table 2 Statistical of the tissue characteristics of muscle fibers in the late embryonic period of four chicken breeds

图4 4个鸡品种肌肉横切面图（40×）Fig.4 Cross-sectional view of the muscle fibers of the four chicken breeds（40×）

3 讨论

肌纤维是骨骼肌基本组成单位，占肌肉质量75%～90%，在胚胎期由单核成肌细胞融合形成[6]。陈宽维等分析蛋鸡、肉鸡、地方鸡和药用鸡肌纤维组织特性，发现不同遗传背景鸡肌纤维特性存在较大差异，说明肌纤维组织学特性与鸡类型有一定关联[7]。Tejeda等利用快速生长型肉鸡和慢速生长型肉鸡研究品种、性别和肌肉部位对肌纤维组织学特性影响，结果发现品种和性别对肌纤维面积影响较小，肌肉部位对肌纤维面积影响较大[8]，与本研究结果一致，即两种肉鸡在同一胚胎时期肌纤维面积差异较小，性别对肌纤维组织学特性影响不显著（P＞0.05），而不同肌肉部位肌纤维面积差异显著（P＜0.05）。赵衍铜等对不同品种肉鸡在110日龄时肌纤维组织特性开展研究，得出品种间肌纤维直径和面积差异显著[9]。因随着年龄增加，肌纤维直径逐渐增大，密度逐渐减小[10]，肉鸡肌纤维增大速度可能产生一定差异。成年后公鸡通过分泌睾酮促进肌肉生长，减少肌内脂质沉淀[11]。李娟和谭丽勤等在1日龄、60和90日龄分别分析不同性别鸡肌纤维直径和密度，同一日龄时，公鸡肌纤维密度高于母鸡，肌纤维直径低于母鸡[12-13]。本研究结果显示性别对肌纤维组织特性影响较小，可能由于胚胎期性腺处于发育初始阶段，激素作用尚未体现，因此胚胎期公母鸡之间肌纤维直径和面积未表现出差异。

鸡胚生长过程中所需营养、能量均由卵黄提供，鸡胚发育至后期需更多能量促进机体生长以保证正常出雏及出雏后的活动。此时卵黄中营养已无法满足鸡胚能量需求，因此胚胎后期供能方式发生转变，脂类代谢减少，糖酵解代谢增多，肝脏糖异生作用加强，进而动员鸡胚胸肌中蛋白质，为机体提供能量[14]。根据肌球蛋白ATP酶在不同pH下活性差异，可将骨骼肌分为I、IIa、IIb 3种类型。其中IIb型肌纤维内含线粒体较少，表现糖酵解特性，而鸡胸肌中有90%～100%肌纤维属于IIb型肌纤维，可为胚胎后期糖酵解活动提供材料[15-16]。胸肌发生动员后，肌纤维中蛋白质减少，胚胎后期胸肌重量降低，肌纤维直径和面积减小，骨骼肌卫星细胞活性降低、数量减少。陈伟研究发现，鸭胚从ED22至出雏当天，其胸肌肌纤维直径减少55%，从组织形态学上证明该阶段肌纤维发生萎缩[17]。对于白来航鸡、北京油鸡、白洛克鸡和科尼什鸡胚胎发育后期胸肌，其肌纤维在ED17和D1时形态差异小（P＞0.05），进一步证明该时期胸肌发生大量糖酵解活动为机体发育供能。家禽胸肌与腿肌肌肉构造不同，其发育机制也存在差异。王珍研究发现AA肉鸡发育至D1时，腿肌比胸肌发育快，表现为肌纤维直径更大，肌纤维密度更小[18]。蒋明雅等研究发现我国地方肉鸡在相同胚龄时，腿肌发育快于胸肌，具体表现为肌纤维直径差异[19]。本研究与以上研究结果一致，即相同发育时期，腿肌发育比胸肌快，如科尼什鸡在D1时胸肌肌纤维直径为3.98μm，腿肌肌纤维直径为7.64μm，二者差异极显著（P＜0.01）。这与胚胎后期胸肌中蛋白质大量降解有关，也可能是鸡胚出雏后腿肌需迅速支持体重和维持运动，因此胚胎后期腿肌发育较快。鸭胚发育至后期，其胸肌和腿肌发育程度表现同样差异，且在出雏后同样存在[20]。对于不同品种鸡之间腿肌发育差异，邓宇翔研究发现在胚胎发育中后期，肉鸡肌纤维密度少于地方鸡，胚胎发育末期则高于地方鸡，可能是由于这一时期肉鸡腿肌中以直径较小的慢速型肌纤维为主[21]。彭琼等研究白羽肉鸡、罗曼粉蛋鸡和地方选育肉鸡品种的肌纤维组织特性，比较3个品种在胚胎期骨骼肌发育特点，结果发现胚胎期肉鸡腿肌重大于蛋鸡，且腿肌分化时间早于胸肌[22]。D1时肉鸡腿肌肌纤维密度显著高于白来航鸡和北京油鸡（P＜0.05），说明胚胎发育后期不同品种鸡腿肌发育速度不同，肉鸡发育快于蛋鸡和地方鸡。

骨骼肌由肌纤维组成，肌肉品质与肌纤维特性直接相关，其中肌纤维数量和肌纤维面积是影响肌肉质量和产量主要因素[11,23]。胚胎期成肌细胞融合形成骨骼肌，肌纤维数量出雏后无变化，因此胚胎期形成的肌纤维数量对出雏后肌肉发育至关重要。本研究结果发现肉鸡白洛克鸡在D1时肌纤维面积为13.95μm2，与王红杨研究结果一致[24]；但北京油鸡在D1时肌纤维面积为15.88μm2，虽略高于白洛克鸡，但并未达显著水平，但王红杨研究结果显示北京油鸡D1肌纤维面积极显著高于科宝肉鸡（P＜0.01），达到36.58μm2[24]。这可能因试验所选肌肉视野不同，导致统计情况存在差异。廖菁研究发现，快速生长型鸡肌纤维数量较慢速生长型鸡多[25]。此外，随着日龄增加，快速生长型鸡肌肉中巨型肌纤维更多，肌纤维更粗，其日增重也越快[26]。胚胎期肌纤维数量与肌纤维面积呈负相关，与肌肉质量呈正相关[27]，本研究结果从形态学上证实该点。对于快大型肉鸡，其胚胎期肌纤维密度较慢速生长型蛋鸡大，其肌纤维面积较慢速生长鸡小，说明快大型肉鸡在胚胎期成肌细胞可更多融合为肌纤维，因此出雏后快大型肉鸡生长更快。肌纤维影响肌纤维束大小，快大型肉鸡出雏后生长过快会导致肌肉横切面相对粗糙，肉质下降[28]。

4 结 论

本研究从4个维度分析鸡在胚胎后期肌纤维组织学形态，结果发现性别对鸡胚胎后期肌纤维组织特性影响小，而品种、胚龄、组织部位对其影响较大。组织形态学研究发现肉鸡在胚胎期间形成单位面积内更多数量肌纤维；ED17为肌纤维形成关键时期；腿肌在胚胎期发育速度较胸肌快。