无创胚胎染色体筛查技术对军队不孕不育夫妇助孕结局的影响

黄 旋，孙 琴，许娟娟，李鸿儒，于月新，姚 兵，陈 莉

0 引 言

根据WHO定义，已婚夫妇性生活正常，未避孕未孕1年即可诊断为不孕症。对于部队官兵而言，由于其职业特殊性，生育问题凸出，尤其是男性不育。部队官兵普遍存在晚婚、晚育现象，更由于夫妻分居两地，容易造成生育问题发现延迟，延误治疗时机[1-2]。采用最前沿的人类辅助生殖技术提高助孕成功率，是增强部队战斗力和凝聚力的主要途径之一。胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)通过胚胎植入前对其进行遗传学分析，筛选出遗传性状正常的胚胎植入母体子宫，可以提高临床妊娠率、降低流产率，并减少畸形儿的出生[3]。但是，目前该技术的标本采集是一种有创活检方法，对胚胎后续发育的影响尚待明确。无创胚胎染色体筛查技术(non-invasive embryo chromosome screening，NICS)，对培养液内极微量的DNA进行扩增，通过游离DNA水平全真反映囊胚的染色体状态[4-5]。该技术完全无创，革新了样本的提取手段，弥补了PGS有创活检取样的缺陷，其应用是否对因男性因素需行辅助生殖助孕治疗的部队不育官兵助孕结局有改善尚未有相关报道。本研究通过比较官兵夫妇中行NICS检测与非检测取卵周期信息与单囊胚复苏移植临床结局，明确NICS技术在官兵辅助生殖技术治疗中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2017年5月至2020年10月在我院生殖医学中心行辅助生殖技术治疗的455对不孕不育官兵夫妇(455个取卵周期，均为第一周期)，其中288对接受IVF治疗，34对因染色体异常进行胚胎植入前遗传学检测(PGT)，133对接受卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)治疗。纳入标准：① ICSI适应证；②子宫形态正常；③符合国家计划生育政策；④同意选择性单囊胚移植；⑤囊胚形态学评级认为符合移植条件(3BC/3CB以上)；⑥签署知情同意书；⑦愿意依从本研究方案，并能够完成本研究。排除标准：①有辅助生殖技术治疗禁忌证的患者；②宫腔形态异常或内膜损伤；③子宫腺肌病；④反复种植失败；⑤复发性流产；⑥染色体异常；⑦其他研究者认为不适合参加本研究的任何情况。本研究经医院伦理委员会批准通过(批准号：2016NZKY-028-02)，患者均签署知情同意书。

1.2 临床分组针对133对实施ICSI方案的患者夫妇进行知情同意谈话，根据意愿进行分组，愿意接受NICS治疗45对，拒绝NICS治疗88对。88对ICSI夫妇中45例取消鲜胚移植全胚胎冷冻，其中26例后续选择行单囊胚解冻移植(ICSI组)；45例进行NICS检测后胚胎进行分析，6例无正常胚胎可用，剩余39例进行单囊胚解冻移植(NICS组)，具体分组流程见图1。

图1 行辅助生殖技术治疗的分组流程图

1.3 辅助生殖流程符合纳入标准的官兵夫妇，所有女方进行常规方案控制性促排卵，待主导卵泡群直径≥17 mm与≥14 mm卵泡数的比例达60%～70%时进行hCG注射扳机。扳机后36 h经阴道B超引导下行取卵术，获卵后经体外培养4～6 h行ICSI，16～20 h后评估受精情况，第2、3天观察胚胎发育情况，第5-7天观察囊胚形成情况。

1.4 检测方法收集胚胎培养第5-7天废弃培养液，采用NICS技术检测囊胚培养液中的染色体整倍体性。培养液收集后通过冷链送至亿康基因公司采用MALBAC-NGS 的方法进行扩增和测序，测序完成后进行染色体拷贝数变异(CNV)分析，均以(46，XN)为参照标准，某一条染色体的增多或减少均判断为染色体非整倍体样本。

1.5 观察指标观察NICS组与ICSI组患者取卵周期中临床信息，包括年龄、BMI、腰臀比、不孕年限、基础性激素、抗苗勒管激素(AMH)、促性腺激素(Gn)用量、Gn天数、hCG日激素、hCG日卵泡数、获卵数、成熟卵子数、受精率、正常受精率、可利用胚胎数、D3优良胚胎数、囊胚形成数、囊胚形成率、优质囊胚数、囊胚培养优质胚胎率。冻融胚胎移植(FET)周期观察2组内膜转化日雌二醇(E2)、孕酮(P)和内膜厚度，临床结局包括临床妊娠率、流产率、持续妊娠率。

2 结 果

2.1 基本信息和取卵周期各项指标比较NICS组与ICSI组患者基础信息比较，行NICS检测的患者双方年龄均增大(均P<0.001)，AMH数值低于ICSI组(P<0.05)，其他指标差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。比较NICS组和ICSI组患者取卵周期各项指标，其中NICS组Gn启动量、hCG日卵泡数、获卵数、成熟卵子数均低于ICSI组(P<0.05)，其他指标差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 ICSI组与NICS组患者基本信息比较

表2 ICSI组与NICS组患者取卵周期各项指标比较

2.2 NICS组与ICSI组FET周期及临床结局比较NICS组和ICSI组FET周期中内膜转化日E2水平、P水平、内膜厚度差异均无统计学意义(P>0.05)。NICS组临床妊娠32例，生化妊娠2例，未妊娠5例，临床妊娠率达82.1%。ICSI组临床妊娠21例，未妊娠5例，临床妊娠率达80.8%，2组临床妊娠率、未妊娠率、生化妊娠率、持续妊娠率、流产率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 ICSI组与NICS组患者FET周期各项指标与临床结局比较

3 讨 论

部队官兵群体由于其职业特殊性，结婚普遍较晚，两地分居、聚少离多是常态，因此造成不孕不育问题凸显，且随着二胎政策的开放，许多官兵夫妇再生育意愿强烈，然而却面临各种生育问题而无法完成自然受孕，促使有生育要求的官兵夫妇选择ART来实现生育。军队自2013年开始推行育龄夫妇不孕不育症集中诊治工作，为广大存在生育困难的官兵夫妇提供绿色通道。但随着全社会不孕不育发生率的增加以及二胎政策的开放，军队自2017年开始实施为患不孕不育症的军队育龄夫妇实施常态化诊治工作，进一步满足官兵健康生育服务需求[6-8]。

本研究中男性官兵439例(96.5%)，女性官兵仅16例(3.5%)，因男方因素或双方因素进行ICSI治疗的有133例，男性官兵在本研究中占绝大多数。已有研究显示部队男性官兵训练强度大、精神紧张，处于特殊工作环境如高温环境、辐射或雷达微波环境均会影响男性生殖健康，造成不育症的发生[1-2]。另外，部队官兵进入ART周期治疗后，男性官兵往往由于部队任务重、管控严格等问题无法多次同时至医院就诊，为了减轻官兵夫妇ART治疗中的精神心理压力、增加妊娠成功率，临床应采取多种策略提高官兵夫妇进行ART的成功率[7-8]。

本研究统计我中心接诊的常态化诊治军队不孕不育夫妇,原发性与继发性不孕症的不孕年限分别为(3.60±1.99)年和(2.41±1.43)年，均较WHO规定的不孕症诊断年限1年显著延长。现实中，官兵夫妇分居两地现象普遍，导致夫妻双方出现生育问题时难以及时发现；再加上晚婚，造成夫妇双方意识到自然生育出现困难时，容易出现高龄生育、延误最佳治疗时机等问题，本研究中的不孕夫妇往往因为年龄的增加要求生育的愿望迫切而更愿意选择NICS治疗。

研究显示，通过ART方式获得的胚胎仍有40%～60%存在染色体异常，且随着女性年龄增大，染色体异常的风险呈上升趋势，染色体异常是造成临床助孕失败的主要原因之一。2018年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》建议PGS的适应证为：女方高龄、不明原因反复自然流产、反复种植失败，以及男方严重畸精子症[3]。因此，对于因部队官兵夫妇因男方因素或高龄因素行ART治疗的同时选择胚胎植入前遗传学筛查对提高临床妊娠率具有一定的价值[9-10]。目前临床主要通过胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术可以发现胚胎染色体异常，并且很多临床研究证实了PGS的有效性，然而PGS的临床应用有一定的限制，首要的即PGS是有创的胚胎活检方法[11-13]。因此，NICS技术在有效筛查胚胎整倍体性的同时减少了有创操作，现有研究已经发现NICS同样可以应用于高龄、复发性流产、反复种植失败人群，且可以改善临床结局[5,14-15]。

本研究行ICSI治疗的133例，39例行NICS检测后首次FET ，26例行ICSI后首次FET。2组取卵周期临床信息显示NICS组夫妻双方年龄均显著高于ICSI组，AMH、获卵数则显著低于ICSI组，而卵巢储备功能、年龄均是是影响妊娠率以及增加胚胎非整倍体的因素。本研究中经NICS检测后进行正常单胚胎移植，39例中临床妊娠数为32例，临床妊娠率高达82.1%；另外有6例检测后无可用胚胎，其中3例再次进行新的周期取卵和胚胎移植后获得临床妊娠，1例进行4次新的取卵周期尚未获得妊娠，2例未进行新的取卵周期。另外，ICSI组26进行单胚胎移植，临床妊娠21例，临床妊娠率达80.8%。NICS组临床妊娠率稍高于ICSI组，对于平均年龄均显著增高的NICS组患者来说，正常临床妊娠率在50%～60%，本研究中其临床妊娠率达82.1%，故经NICS筛选后移植正常囊胚可以增加临床妊娠率，NICS可以成为不孕不育官兵增加临床成功率的重要临床选择。