猕猴桃溃疡病菌拮抗菌的筛选、鉴定及其对植物病原真菌的抗性

朱海云 马瑜 柯杨 李勃

（陕西省微生物研究所，西安 710043）

猕猴桃溃疡病是一种由丁香假单胞菌猕猴桃致病 变 种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的细菌性病害，主要危害树干，枝条，叶片、花蕾，严重时造成整株枯死，常导致毁灭果园的严重后果。自19世纪80年代在日本爆发后，先后席卷中国、韩国、意大利、新西兰、葡萄牙、西班牙、土耳其等各猕猴桃主产区［1］。Psa具有强致病力和传染性，不仅可存活于落叶和修剪的枝条中，甚至还可附着在无症状的叶片中，给世界猕猴桃产业的发展造成了严重的威胁。近年来，针对猕猴桃溃疡病的防治主要依赖于铜制剂和农用链霉素［2］，但是长期施用此类药剂不仅会导致病原菌产生抗药 性［3-4］，还会对植物及种植环境微生物群落产生毒性和污染。因此，亟需寻找有效的环境友好型的防治药剂，如细菌、放线菌和木霉等进行猕猴桃溃疡病防治［5-7］。

植物内生菌（endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物组织和器官内部而不引起宿主任何症状的真菌或细菌［8］。内生细菌能够分泌多种抗菌物质，在促进宿主植物生长的同时增强其抗逆境、抗病虫害能力［9］，是生物活性物质的重要来源［10］。已有研究表明，植物内生细菌对病原细菌、植物病原真菌具有明显的拮抗活性［11-12］，是潜在的生防资源库。银杏（Ginkgo biloba L.）是银杏属现存的唯一生存种，其果实和叶子具有很高的药用价值，且其在生长期很少感染病虫害。项目组在前期研究中从银杏根、茎及枝叶中分离得到多株不同类型内生细菌［13］，现以猕猴桃溃疡病病原菌Psa为靶标，开展抗猕猴桃溃疡病生防内生细菌的分离、筛选及鉴定工作，并通过其对多种常见植物病原菌真菌的拮抗试验，测定该菌株的抑菌谱，旨为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 野生银杏（G. biloba L.）标本采自秦岭太白山自然保护区。

1.1.2 供试病原菌 Pseudomonas syringae pv. Actinidiae；Alternaria alternata；Botrytis cinerea；Fusarium oxysporum；Trichoderma virens；Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum；Botryosphaeria dothidea。以上菌种均由本实验室从致病植株中分离、鉴定，并保藏于陕西省微生物研究所菌种保藏中心（SMRL）。

1.1.3 培养基 PSA培养基：蛋白胨 0.5%，蔗糖 2%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.025%，琼 脂15%，余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20 min。PDA培养基：土豆200 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂15 g/L，余量为水，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20 min。发酵培养基［14］：葡萄糖2.5%，蛋白胨0.05%，可溶性淀粉4%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，K2HPO40.25%，CaCO30.12%，MnSO40.035%，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 银杏内生细菌的分离、纯化 参考李勃等［13］的三步表面消毒法。

1.2.2 拮抗菌的筛选 以猕猴桃溃疡病病原菌Psa为供试靶标菌，采用管碟法［15］，筛选对Psa具有拮抗作用的内生细菌。取1 mL浓度为108CFU/mL的Psa菌悬液加至50℃水浴保温备用的100 mL PSA培养基，混匀倒平板，以无菌水为对照。待培养基冷却后，向每个平板上均匀放置3个牛津杯，每个牛津杯加入200 μL待测发酵上清液，于28℃下培养48 h后，测量抑菌圈直径，每个实验做3次平行，取平均值。

1.2.3 拮抗菌的鉴定 形态观察及理化实验参考《伯杰氏细菌系统手册（第九版英文）》和《常见细菌鉴定手册》。

用TaKaRa全基因组提取试剂盒提取菌株基因组DAN，采用细菌16S rRNA通用引物27F（5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′） 和1492R（5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩 增 细 菌 的16S rRNA基因［16］。PCR扩增反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2.5 min，共35个循环；72℃延伸5 min。将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。当鉴定菌株的16S rDNA序列与模式菌株的同源性大于99%时，可以对其进行种水平上的鉴定。在GenBank中采用BLAST程序对16S rRNA序列进行比对分析［17］，并采用MEGA 6.0软件中的邻接法（neighborjoining，NJ）构建系统发育树。

1.2.4 猕猴桃溃疡病盆栽防治实验 将有5-7片叶子的猕猴桃幼苗移栽到花盆中，在接种病原菌前2 d用MA23发酵液上清对猕猴桃幼苗进行全株喷雾，之后用针刺法接种病原菌，接种1 d和5 d后分别再用MA23发酵液上清进行全株喷雾防治，全程设置清水对照，接种9 d后统计病情指数。以黄色晕圈直径或者病斑面积代表病级值，计算防效：

1.2.5 拮抗菌真菌抑菌谱的检测 采用平板对峙法检测拮抗菌对病原真菌的抑菌谱［18］。用直径5 mm的打孔器分别在培养1 d的细菌平板和培养5 d的病原真菌平板上打孔，获得同质等量的菌块。将真菌菌块置于直径为90 cm的PDA平板中心，同时在距平皿中心22.5 cm处的圆周上均匀放置3块细菌菌块，并设置不放置细菌菌块的平板对照，各设3个重复，于28℃培养5 d后测量细菌及病原菌两接种点连线上病原菌的菌落半径，计算抑菌率。

2 结果

2.1 银杏树内生菌的分离与拮抗菌的筛选

共分离到86株银杏内生细菌，其中有7株对Psa具有拮抗活性，而菌株MA23的拮抗活性最为显著（图1）。

图1 Psa拮抗内生菌的筛选Fig. 1 Screening of antagonistic endophytic bacteria against Psa

2.2 拮抗菌株MA23的鉴定

2.2.1 形态特征及生理生化特征 在LB培养基上，培养初期菌落为乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落稍隆起，表面湿润，直径1-2 mm；培养后期菌落呈淡黄色，边缘不规则，表面干燥有褶皱（图2-A）；在液体培养基中静置培养，表面形成白色菌膜。菌体细胞为杆状，末端方形，呈短链或长链状，大小约1.1 μm×3.5 μm（图2-B）；产芽孢，芽孢为柱状，中生或近中生，孢囊无明显膨胀（图2-C）。MA23菌株的生理生化特征见表1。

表1 MA23菌株生理生化鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical identification results of MA23

图2 MA23菌株的形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of MA23

2.2.2 菌株MA23的分子生物学鉴定 菌株MA23的16S rDNA序列长度为1 474 bp。将该序列与GenBank数据库中的核酸序列进行同源性比对，发现MA23菌株与蜡样芽孢杆菌的相似性达到100%。选择相似性较高的菌株及芽孢属等相关菌株的16S rDNA序列构建系统发育树，结果见图3。结合形态特征、生理生化特征以及16S rDNA系统发育树结果最终确定MA23菌株在细菌分类学上属于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

图3 MA23菌株的N-J系统发育树Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of MA23

2.3 拮抗菌MA23对猕猴桃溃疡病的盆栽防治实验

用MA23发酵液上清对猕猴桃溃疡病进行盆栽防治实验，并在接种病原9 d后统计病情指数，结果显示MA23对猕猴桃溃疡病的盆栽防治效率为93.6%。从图4可以看出，接种病原9 d后，清水对照组叶片出现不规则的褐色斑点，周围有黄色的晕圈，发病严重；而MA23防治组叶片则很少出现褐色斑点，仅出现极少数的面积较小的黄斑点，这说明MA23对猕猴桃溃疡病具有较好的盆栽防治效果。

图4 MA23对猕猴桃溃疡病的盆栽防治实验Fig. 4 Pot experiment of MA23 controlling kiwifruit canker

2.4 拮抗菌MA23对病原真菌的抑制

MA23菌株对6种真菌病原菌的平板对峙实验如图5所示，对6种真菌病原的抑制率见表2。A23菌株对Botrytis cinerea（番茄灰霉病病原）和Alternaria alternata（苹果黑斑病病原）具有很好的抑制效果，抑制率超过90%；对Trichoderma virens（郁金香腐烂病病原）和Fusarium oxysporum（甘薯干腐病病原）具有抑制效果，抑制率在70%以上；对Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum（棉花枯萎病病原）也具有一定的抑制效果，抑制率为54.21%；而对Botryosphaeria dothidea（苹果干腐病病原）抑制效果不佳，抑制率仅为29.9%。

图5 蜡样芽孢杆菌MA23对病原真菌的平板对峙实验Fig. 5 Confrontation experiments of Bacillus cereus MA23 against pathogenic fungi

表2 MA23对不同植物病原真菌的抑制率Table 2 Inhibition ratios of MA23 against different plant pathogenic fungi

3 讨论

由于Psa定殖于猕猴桃植株组织内部，因此用于猕猴桃溃疡病防治的生防菌需要能够有效定殖于植株组织内部而发挥防治作用。研究表明植物内生菌能广泛定殖于宿主的不同组织，它们通过吸附、侵入和定殖3个过程进入到植物体内，且能在植物体内转移［19-20］。Wicaksono等［5］证明内生假单胞菌能够有效定殖于猕猴桃植株内，且能减轻猕猴桃溃疡病症状。本研究所筛选到的MA23菌株是一株可适应多种环境的内生蜡样芽孢杆菌，能够在猕猴桃植株内有效定殖，进而发挥防治猕猴桃溃疡病的作用。

蜡样芽孢杆菌是一种能产生抗逆性芽孢的革兰氏阳性细菌，它分布广泛，易于培养和保存，抗逆性强，能适应各种环境。蜡样芽孢杆菌可产生多种抑菌活性物质，如抗生素、细菌素、抗菌肽等［21-23］，可有效抑制病原微生物的繁殖，对植物根际有促生和防病等功效［24-25］。大量研究表明，蜡样芽孢杆菌不但可以有效抑制细菌，还对多种植物病原真菌具有较好的抑制效果。例如，蜡样芽孢杆菌ANTI-8098A能很好地定殖于番茄植株内，对番茄青枯病（病原为Ralstonia solanacearum）有较好的防效［26］；蜡样芽孢杆菌B3-7对小麦纹枯病（病原为Rhizoctonia cerealis）和小麦全蚀病（病原为Gaeumannomyces graminis）均有防治效果［27-28］；蜡样芽孢杆菌BCJB01对可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）有抑制作用，可用于防治葡萄溃疡病［29］。综合以往的研究结果可知，蜡样芽孢杆菌对真菌及革兰氏阳性菌均具有很好的抑制作用，而对革兰氏阴性菌的抑制作用却少见报道。本研究所筛选到的蜡样芽孢杆菌MA23不仅对革兰氏阴性菌Psa具有较好的拮抗活性，而且对多种植物病原真菌也具有较好的抑制效果，说明MA23抑菌谱较广，在农业病害防治中具有更广泛的应用价值和较好的应用前景。

本研究以Psa为靶标菌通过抑菌圈法从野生银杏内生细菌中筛选到了拮抗活性菌株MA23，该菌株被鉴定为蜡样芽孢杆菌。蜡样芽孢杆菌MA23不但可以在体外有效抑制Psa，而且对多种植物真菌病原也具有抑制效果，因此可将其进一步应用于猕猴桃溃疡病的田间防治，并可开展其对猕猴桃真菌病原菌的防治研究。为了有效提高蜡样芽胞杆菌MA23的田间防治效果，仍需要开展一系列的研究工作，如优化发酵工艺，提高其抑菌活性；研究其在猕猴桃植株内的定殖规律以便于合理安排喷施方式及时间等。

4 结论

本研究通过表面消毒法从野生银杏中分离到86株内生细菌。以Psa为指标菌，通过抑菌圈法筛选到7株对Psa具有拮抗活性的菌株，其中MA23菌株对Psa的拮抗活性最高。结合形态特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析，将MA23鉴定为蜡样芽孢杆菌。蜡样芽孢杆菌MA23不仅对猕猴桃溃疡病具有很好的防治效果，盆栽防治效率为93.6%，而且，其对植物病原真 菌Alternaria alternata、Botrytis cinerea、Fusarium oxysporum、Trichoderma virens和Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum也具有抑制效果。