密度、施氮量和留叶数对渠首1号香气特性彰显的影响

张谦 薛宇 贺凌霄 吴疆 程玉渊 杨铁钊 丁永乐 徐世晓 薛刚

（1. 河南农业大学烟草学院，郑州450002；2. 河南省烟草公司洛阳市公司，洛阳 471000；3. 河南省烟草公司南阳市公司，南阳473000）

类西柏烷类化合物和石油醚提取物是烟叶风格特色重要决定因素，类西柏烷类主要包括西柏三烯醇类、茄酮、降茄二酮等物质，是烟草次生代谢类西柏烷二萜的主要成分，以叶面腺毛分泌物的形式存在于烟草中［1］，腺毛由植物的表皮细胞分化而来，在植物次生代谢物质积累和利用以及抵御外界不良因素起重要作用［2］。烟草叶片腺毛丰富，种类多样且具有较强的分泌能力，腺毛分泌物是烟草香味香气组分的重要前体物，与烟草的香味有密切联系，分泌物中有些成分还具有抗病、抗虫、抗氧化的作用［3-4］，因此提高烟草叶片腺毛密度是提高烟草抗性和改良烟叶品质的重要途径之一［5］。烟草叶片腺毛分泌物的主要化学成分是西柏三烯二醇，占腺毛分泌物总量的60%以上［6］，在烟叶生长和后期调制过程中，西柏三烯二醇大部分降解为以茄酮为主要代表的多种致香成分［7］。而茄酮可降解为茄醇、茄尼呋喃和降茄二酮等对烟草的香吃味影响很大的物质。前人研究显示，诸多因素对烤烟西柏三烯二醇的代谢都有影响，例如海拔高度、遮阴、光照条件以及不同的栽培措施［8-10］。烟叶石油醚提取物通常被作为衡量烟叶品质和香气的重要指标之一，烟草中石油醚提取物的质量分数受生态环境因素和栽培技术的影响［11］。种植密度、施氮量及打顶留叶数是烟叶在大田生产过程中最基础的栽培技术，同时也是影响烟叶产质量和烟农收益的关键因素［12］。合理种植密度和单株留叶数可以保证烟株合理的群体质量，并能够调控和促进烟株的生长发育，对烟叶腺毛密度及其分泌物也有一定的影响［13］。氮元素对烟叶优良品质的形成以及风格特色的彰显有重要 贡献［14］。

渠首1号是河南南阳地方特色品种，具有生产典型河南浓香型烟叶的潜质。但近年来由于栽培习惯的变化，导致渠首1号烟叶风格特色彰显不足。目前，关于种植密度、施氮量及打顶留叶数对烟草产质量的研究多注重对现象的分析，深入到分子水平对叶面分泌物代谢过程中的关键基因进行分析的研究还不多见。因此，本研究对比各处理类西柏烷类化合物和石油醚提取物含量，同时结合对叶面腺毛密度、腺毛分泌物主要成分烤烟西柏三烯二醇代谢关键基因CYC-1和CYP71D16的表达情况及感官评价结果的分析，研究不同种植密度、施氮量和留叶数对渠首1号类西柏烷类化合物和石油醚提取物含量的影响，可为大田生产措施的调整上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2019年在河南省南阳市方城县清河乡金叶园实验基地进行，供试土壤类型为棕壤土，土壤肥力中等，前茬作物烤烟，参试烤烟品种为渠首1号（南阳自育品种）。试验按3因素3水平设置，试验采用正交设计L9（34），共计9个处理组合（表1、表2），每个处理组合重复3次，共27个区，每个小区面积为66.7 m2，小区采用随机区组排列，四周设保护行。2月14日播种，漂浮育苗，4月22日移栽大田，8月1日第1次采烤（烤房使用密集式烤房，烘烤工艺按照三段式烘烤）。烤烟各生产环节按当地优质烟叶生产技术标准进行管理。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

表2 试验安排表Table 2 Test schedule

1.2 测定项目与方法

1.2.1 腺毛密度 采各处理烟株中部叶片（从下往上数第 14 叶位）叶龄 60 d的叶片，通过电子显微镜扫描观察并统计单位面积的腺毛数量。

1.2.2 叶面腺毛分泌物的提取与测定 腺毛分泌物的提取按照张景华［1］的方法。

1.2.3 荧光定量 PCR 以烟草Actin基因（GenebankAccession No. AB158612）为内参，各基因名称及引物如表3。荧光定量PCR体系（20 μL）：2×SYBR Green qPCR Mix，10 μmol/L的-Forward Primer和Reverse Primer各0.4 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 1 μL，nuclease-free water 7.8 μL。PCR反应程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s， 72℃ 45 s，40个循环；95℃ 15 s，55℃ 30 s， 95℃ 15 s。

表3 各基因名称及引物Table 3 Gene names and primers

1.2.4 茄酮的测定方法 采用“水蒸气蒸馏-二氯甲烷萃取”法对烟叶进行前处理，经前处理制备的化验样品，加内标后（内标为硝基苯），运用气质连用仪进行测定，由GC/MS鉴定结果和NIST库进行检索定性。茄酮由国家烟草栽培生理生化研究基地进行测定。

1.2.5 石油醚提取物 由专业分级人员每个处理分别随机选取 C3F等级15片烟样，烘干粉碎供，采用索氏提取法测定烟叶样品的石油醚提取物含量［14］；

1.2.6 感官质量评价 将烤后烟中部叶制成单料烟，送至河南中烟工业公司，按照“YC/T138-1998 烟草及烟草制品感官评吸方法”请6位专家进行评吸。

1.2.7 数据分析 采用Excel 2010、DPS统计软件对试验数据进行方差分析，显著性检验用Duncan新复极差法。

2 结果

2.1 种植密度、施氮量和留叶数对烟叶腺毛密度的影响

由表4可知，短柄腺毛密度T4最高，为11.67根 /mm2，T4、T2、T5无显著差异，T9最低，为8.15根 /mm2，T7、T8和T9无显著差异，其它处理处于中间水平且差异不显著；长腺毛密度也为T4最高，为21.63根 /mm2，与其他处理差异显著，T7、T2处理长柄腺毛密度次之且无差异显著，T9最低，为16.59根 /mm2，T1、T8和T9差异不显著。腺毛总密度也为T4最高，为33.3根 /mm2，与其他处理差异显著，T2、T5处理腺毛总密度次之且无差异显著，T9最低，为24.74根 /mm2，T1、T6、T7和T9差异不显著。

表4 各处理组合间烟叶腺毛密度差异分析Table 4 Analysis of the difference in density of tobacco leaf glandular hair among the treatment combinations（root/mm2）

由表5可得，短柄腺毛密度随种植密度、施氮量和单株留叶数增加而先增后减小，腺毛总密度随种植密度和留叶数的变化与短柄腺毛一致，不同的是腺毛总密度随时施氮量的增加而减小。根据极差分析，对短柄腺毛密度和腺毛总密度的影响由大到小依次为种植密度、留叶数、施氮量；长柄腺毛密度随种植密度和留叶数而先增后减小，长柄腺毛密度随着施氮量的增加而减小。对长柄腺毛密度影响由大到小依次为施氮量、留叶数、种植密度。

表5 叶面腺毛密度的边际值和极差Table 5 The marginal value and range of leaf glandular hair density

2.2 种植密度、施氮量和留叶数对烟叶腺毛分泌物的影响

种植密度、施氮量及留叶数对烟叶腺毛分泌物影响的正交试验方差分析结果（表6）表明，西柏三烯一醇含量占腺毛分泌物总量极少，西柏三烯二醇含量约占腺毛分泌物总量的67%-72%，烷烃类物质约占腺毛分泌物13%-16%，西柏三烯二醇是烟叶腺毛分泌物的主要组分。比较各处理组合，西柏三烯二醇含量T4最高，为54.21 μg/cm。各处理组合西柏三烯二醇的含量高低排序为：T4>T2>T5>T7>T1>T8>T3>T6>T9；腺毛分泌物总量T4最高，为74.38 μg/cm，各处理腺毛分泌物总量高低分别为：T4>T7>T2>T5>T1>T8>T3>T6>T9；烷烃类物质含量T5最高，为11.25 g/cm，T4含量次之，为11.066 7 μg/cm，为而T9含量最少，仅为8.436 7 μg/cm。总体来看，T4处理西柏三烯一醇含量、西柏三烯二醇含量和腺毛分泌物总和含量均为最高，在中等种植密度，低施氮量及中等留叶数的条件下，烟叶可获得较高的腺毛分泌物含量。

表6 各处理组合的烟叶腺毛分泌物含量差异分析Table 6 Analysis of the difference in the secretion content of the tobacco leaf glandular hairs of each treatment combination（μg/cm2）

由表7可知，烟片西柏三烯一醇总量和西柏三烯二醇总量均随着种植密度的增加而先增加后下降，随施氮量的增加而下降。西柏三烯一醇总量随着留叶数的增加而增加，西柏三烯二醇总量随着种植密度和留叶数的增加而先增加后下降。3个因子对西柏三烯一醇总量和西柏三烯二醇总量影响由大到小依次为施氮量、种植密度、留叶数。

表7 腺毛分泌物含量的边际值和极差Table 7 Marginal value and range of glandular hair secretion content（μg/cm2）

烷烃类随着种植密度和留叶数的增加而先增加后下降，且各处理间差异显著；随施氮量的增加而下降，且各处理间差异显著；随留叶数的增加而下降，且各处理间差异显著。种植密度和施氮量是影响烷烃类含量的重要因素，留叶数影响力最小。

腺毛分泌物总量变换规律与西柏三烯二醇总量变换规律一致，3个因子对腺毛分泌物总量影响由大到小依次为施氮量、留叶数、种植密度。总体来看，当种植密度中等时，西柏三烯一醇含量、西柏三烯二醇含量、烷烃类和腺毛分泌物总量均处于最高值，施氮量水平较低时，四者表现最好，留叶数为中等水平时，西柏三烯一醇总量、西柏三烯二醇总量和腺毛分泌物均处于最高值，当种植密度中等，施氮量水平较低，留叶数中等时，南阳烟区渠首1号烟叶腺毛分泌物较高。

2.3 种植密度、施氮量和留叶数对西柏三烯二醇代谢相关基因相对表达量的影响

由图1可知各处理中，T4的CYC-1相对表达量最高，为1.477，其次是T5，两者无明显差异，T9表达量最低，且T9与T6差异不显著，与其他处理差异显著，各处理CYC-1相对表达量表 现 趋 势 为：T4>T5>T2>T7>T8>T1>T3>T6>T9；CYP71D16各处理CYC-1相对表达量表现趋势为T4>T7>T2>T5>T1>T9>T3>T9>T6，相对表达量也是T4最高，为1.3267，是最低处理T6的2.17倍，两者均与其他处理差异显著，T7、T2和T5三者差异不显著，T1与其他处理差异显著，T8、T3和T9三者差异不显著。前面的分析已经表明不同栽培措施能使烟叶分泌物主要成分西柏三烯二醇的含量发生变化，与烟叶西柏三烯二醇代谢密切相关的基因相对表达量出现相似变化规律则可以很好地解释这一现象。再一次证明西柏三烯二醇的代谢与CYC-1、CYP71D16基因密切相关。

图1 各处理组合CYC-1和CYP71D16基因的相对表达量Fig.1 Relative expression levels of CYC-1 and CYP71D16 genes in each treatment combination

由表8可知CYC-1和CYP71D16相对表达量均随种植密度的增加而先增大后减小，且不同因素水平差异显著，CYC-1相对表达量随施氮量的增加而先增大后减小，但是M1和M2差异不显著，CYP71D16相对表达量施氮量的增加而减小。CYC-1和CYP71D16的相对表达量均随留叶数的增加而先增大后增加。施氮量是影响二者最重要的因素，留叶数和种植密度对CYC-1影响力相当，留叶数是CYP71D16的相对表达量的次要因素，种植密度影响最小。

表8 CYC-1和CYP71D16基因相对表达量的边际值和极差Table 8 The marginal value and range of the relative expression of CYC-1 and CYP71D16 genes

2.4 种植密度、施氮量和留叶数对烟叶茄酮含量的影响

各处理茄酮的含量高低分别为：T5>T4>T2> T7>T8>T3>T1>T9>T6，在 0.05 差异水平上，T5茄酮含量最高，为79.65 μg/g，T6最低，为44.85 μg/g，除T3和T8外，其他各处理差异显著（图2）。

图2 各处理组合间茄酮含量差异分析Fig.2 Analysis of the difference in solanone content between treatment combinations

茄酮含量随着种植密度和施氮量的增加而先增加后下降，且各处理间差异显著；随留叶数的增加而增加，各处理间差异显著；施氮量和留叶数是影响茄酮含量的重要因素，种植密度影响力最小 （表9）。

表9 不同因素水平下烟叶茄酮的边际值和极差Table 9 Marginal value and range of solanone in tobacco leaves under different factor levels（μg/g）

2.5 种植密度、施氮量和留叶数对烤后烟石油醚提取物质量分数的影响

对烤后烟中部叶石油醚提取物质量分数的影响密度、施氮量及留叶数的正交试验方差分析结果（图3）表明，在0.05差异水平上，T5石油醚提取物质量分数最高，为7.9%，T1最低，为4.43%，两者均分别与其它处理差异显著，T8石油醚提取物质量分数居第2位，且与T4无显著差异，其它处理间差异显著。

图3 各处理组合间烤后烟石油醚提取物质量分数差异分析Fig.3 Analysis of the difference in mass fraction of petroleum ether extract of flue-cured tobacco among various treatment combinations

从边际值来看，石油醚提取物质量分数随着种植密度和施氮量的增大而先增大后减小，且3个水平差异显著；随着留叶数的增大而增大，M1与M2和M3差异显著。据极差分析，3个因子对石油醚提取物影响由大到小依次为种植密度、施氮量、留叶数（表10）。

表10 不同因素烤后烟石油醚的边际值和极差Table 10 Marginal value and range of petroleum ether of flue-cured tobacco after different factors

2.6 种植密度、施氮量和留叶数对烤后烟感官质量评价的影响

由表11和表12可知，施氮量是影响中部叶感官质量评价的主要因素，种植密度是次重要因素，留叶数是次要因素。就香气特征而言，处理T5的香气质感和香气量表现最好，其次为处理T8，T2处理最差。就烟气特征而言，处理T1表现较优，其次为处理T5，T2处理最差处理。就吃味特征而言处理T1表现较优，其次为处理T5，T6处理最差处理。处理T5在总分表现最好，为69.4分，其次为处理T8，T6处理最差，仅为57.2分。从边际值来看，随施氮量和种植密度的增加，总分呈反V字型变化，随着留叶数的增加，总分呈V字型变化。推荐处理组合为M2N2L3，可获得较高的感官质量评分。

表12 不同因素烤后烟感官质量评价边际值和极差Table 12 Marginal value and range of sensory quality evaluation of flue-cured tobacco after different factors

3 讨论

生态因素、遗传因素和栽培因素共同影响了烟叶风格的形成，其中生态条件决定了烟叶香气风格的类型和潜力，而栽培因素决定了风格特色的显示度和彰显度。

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烟草腺毛密度越高，香气量越足［15-16］。本实验中腺毛总密度随种植密度和留叶数增加而先增加后减小，密度过大或过小及留叶数过多过少均不利于腺毛密度增加，这可能与烟叶个体的发育和营养分配有关［17］，也可能与种植密度过大或留叶数过多造成的烟株间相互遮阴有关［8］；随施氮量的增加腺毛总密度减小，这与卫宣志［18］研究一致。综合来说，在M2N1L2的条件时，渠首1号在本地区腺毛总密度可以达到较大值。

杨铁钊等［19］研究指出中部位在叶龄 60 d 时叶面分泌物量达到最大值，之后腺毛分泌物含量逐渐下降，因此本研究选取此时期进行叶面分泌物的测定。种植密度，施氮量和留叶数均对腺毛分泌物有一定的影响［20］。本实验中，西柏三烯一醇总和随种植密度和施氮量变化不大，随施氮量的增加而减小。烷烃类物质含量则在中等密度，施氮量水平较低，留叶数较多的条件下达到最大值。西柏三烯二醇总和含量和腺毛分泌物总和变化基本一致，说明了西柏三烯二醇是烟叶腺毛分泌物的主要成分，两者均在M2N1L2的条件下达到最大值且不同因素水平下差异明显，对二者影响最大的因素为施氮量，增施氮肥不利于烟草叶面分泌物的合成和积累，这与史宏志等［21］研究一致，原因可能是由于增施氮肥后叶片较大，在整片叶腺毛分泌物总量一致的情况下，单位叶面积腺毛分泌物含量降低。

王冬等［22］研究表明，CYC-1和CYP71D16直接参与了西柏三烯二醇的合成。其中西柏三烯醇合成酶以香叶基焦磷酸为底物催化合成西柏三烯一醇，CYC-1则是编码西柏三烯一醇合成酶的基因，CYP71D16作为编码细胞色素 P450加氧酶的基因则参与调控了西柏三烯一醇向西柏三烯二醇转变的过程［23］，CYC-1和 CYP71D16在类西柏烷二萜合成中发挥着重要的作用，直接决定着植物腺毛分泌物中西柏三烯一醇和西柏三烯二醇的含量［24］。较高光照强度促进CYC-1和CYP71D16的上调表达，本实验中CYC-1和CYP71D16相对表达量均在中等种植密度下达到最大值，这与前人研究结果一致［22］，总体当种植密度中等，施氮量水平中低等水平，留叶数较多时，CYC-1和CYP71D16可以上调表达。

石油醚提取物是衡量烟叶品质优劣的重要指标，对烟叶外观质感也有影响［25］，烟叶中石油醚提取物与其香气量呈正相关关系［26］。本实验中烟叶石油醚提取物随着种植密度和施氮量的增大而先增大后减小；随着留叶数的增大而减小，这与赵铭钦等［27］和曹红云等［28］研究一致。腺毛分泌物含量较高的，其石油醚提取物含量也较高，表明腺毛分泌物含量与石油醚提取物含量有一定的相关性。综合来说，当M2N2L2时，渠首1号在本地区石油醚提取物可以达到较大值。

茄酮是烟叶主体香味成分之一，其在改善烟草香吃味和醇和烟气方面有很大益处［29］，本实验中茄酮随着种植密度和施氮量的增大而先增大后减小，随着留叶数的增大而增大，这与许自成［30］研究一致，综合来说，当M2N2L3时，渠首1号在本地区石油醚提取物可以达到较大值。西柏三烯二醇在酶解或加热等条件下降解，在键的断裂过程中，得到了茄酮，本实验中各处理茄酮含量与西柏三烯二醇含量不完全一致，可能是后期雨水过多，西柏三烯二醇转化不完全造成的。

感官质量是烟叶质量的核心和基础，是衡量烟叶可用性的重要指标［31］。感官质量的优劣会对卷烟产品的质量造成直接影响。本研究中密度、施氮量对烟叶的评吸质量都有影响，施氮量是主要因素，这与张晨东等［32］研究结果一致；当M2N2L3时，感官质量取的最好评价。随着施氮量增加烟叶感官质量评价呈上升趋势，超出一定范围再增施氮肥，感官评吸质量下降，这与占俊文［33］和刘国［34］研究结果一致。烤烟感官质量随着烟株密度的增大而先增大再减小，这与张渝婕［35］研究不一致，可能与留叶数对感官质量的影响有关。烤烟感官质量评价随的留叶数增多而先增加，这与胡丽涛［36］研究不一致，可能是本实验中的渠首1号与前人实验中K326品种差异造成的。虽然腺毛分泌物在施氮量较低的条件下可以得到较大值，但是较低施氮水平导致烟株发育不充分，各化学成分不协调，所以影响了最终的感官质量评价结果。本次感官质量评价结果也证实茄酮对于改善烟草的香味和提升抽吸品质也有重要的贡献。

烟叶中致香物质指标可分为两类，第一类为指示“清香型”类物质，包括多酚类物质、叶绿素、类胡萝卜素及质体色素等；第2类倾向指示烤烟为“浓香型”，包括类西柏烷类致香物质、石油醚提取物和美拉德反应产物［37-40］。本实验中渠首1号作为浓香型烟叶，其类西柏烷类致香物质含量、石油醚提取物含量在中等种植密度，中低施氮量及较多留叶数的条件下取得最大值，考虑产量产值（另文发表）及感官质量评价，渠首1号采用中等施氮量较为合适。

4 结论

综合各项指标来看，密度15 500株/hm2、施氮量45 kg/hm2和留叶数22片时，烟叶中茄酮含量、石油醚提取物含量均为最大值，腺毛密度，叶面分泌物含量及关键基因相对表达量也都处于较高水平，且茄酮转化比较充分，烤后烟叶感官质量评价最高，香味得到了改善，是彰显渠首1号浓香型烟叶风格的适宜栽培方式。这表明渠首1号在豫南烟区种植时应采用中等密度，合理施用氮肥、适当增加留叶数。初步认为渠首1号在豫南最优的栽培措施组合为：密度15 500株/hm2、施氮量45 kg/hm2、留叶数22片，建议在生产中进行示范应用和推广。