非洲菊GjPAL的克隆及表达分析

郝向阳 刘范 武欢 王斌 孙雪丽 项蕾蕾 王天池 赖钟雄 程春振，2

（1. 福建农林大学园艺学院，福州 350002；2. 山西农业大学园艺学院，太谷 030801）

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是连接植物初生和次生代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的关键限速酶［1-2］，在植物生长发育过程中扮演着重要角色［3-5］。此外，PAL与次生代谢产物（如木质素、植保素、类黄酮等物质）的含量密切相关，在植物响应生物和非生物胁迫过程中也发挥着重要作用［6-7］。

植物PAL基因多以小的多基因家族形式存在，拟南芥［8］、水稻［9］、柳树［6］和杨树［10］分别有4、9、5和5个PAL成员。PAL基因的表达受多种非生物逆境影响显著，如：水稻OsPALs（除OsPAL8外）的表达至少受干旱、低温、NaCl和ABA等4种胁迫中的一种影响显著［9，11］。PAL基因在植物生物胁迫应答过程中也发挥着重要作用。枯草芽孢杆菌CBR05（Bacillus subtilis CBR05）可以通过诱导番茄PAL基因的表达进而提高番茄对野油菜黄单孢 菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）的 抗性［12］；茶树PAL基因的表达受炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、拟 盘 多 毛 孢 菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）和 茶 尺 蠖（Ectropis oblique）显著诱导，可能在茶树抵御真菌和昆虫病害中发挥作用［13］。陆地棉GhPAL1和GhPAL8的表达受黄萎菌诱导，且在抗病品种中的表达量约为感病品种的8倍，说明它们的表达水平可能与陆地棉黄萎病抗性息息相关［14］。此外，还有研究指出PAL参与水杨酸（SA）的合成调控［15-18］，说明它广泛参与植物的抗逆防御反应。

非洲菊是世界重要的鲜切花，被认为是研究花色的理想模式植物，经济、观赏和科学研究价值极高［19-21］。近些年来，我国非洲菊产业发展势头良好，栽培面积逐步增大，但温度、水分、土壤等环境因子以及病虫害等对该产业的影响也日益凸显［22-24］。利用转基因育种手段提高非洲菊抗逆性是非洲菊育种的重要研究方向。

鉴于PAL基因在植物抗逆防御过程中的作用，本研究将实验室前期获得的非洲菊转录组中的21个PAL基因片段［25］进行了序列拼接，经RACE-PCR和RT-PCR克隆获得4个包含完整CDS的非洲菊PAL基因，利用生物信息学方法分析它们及其编码蛋白的序列特征，同时利用qRT-PCR技术研究它们在不同胁迫处理下的表达模式。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用非洲菊品种“玲珑”由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。取生长状态良好、长势一致、株高约为30 cm植株的叶、叶柄和根，用于RNA提取。SA、干旱、盐胁迫和低温等非生物胁迫分别使用100 μmol/L SA、30% PEG、200 mmol/L NaCl和4℃低温处理，使用浸根法进行隐地疫霉接种处理，具体步骤参照郝向阳等［26］方法。所有处理均重复3次，取样后立即置于液氮中速冻，-80℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 基因筛选及克隆 从非洲菊转录组数据中筛选命名为PAL的unigene序列，将这些序列进行进一步拼接后选择了4个长度较长的PAL基因，其中，1个缺少5′端和3′端序列（GjPAL1），2个具有完整的开放阅读框（GjPAL2和GjPAL3），另外1个缺失3′端序列（GjPAL4）。

采用Trizol RNA提取试剂盒（TaKaRa）提取非洲菊叶片总RNA；采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit分 别 合 成5′及3′RACE cDNA，用于上述不具有完整CDS的GjPAL基因3′端和5′端的克隆；采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，用于PAL基因的全长验证，25 μL PCR反应体系包含：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL和上下游引物各1 μL。PCR扩增程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55-59℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。采用1%琼脂糖凝胶检测PCR产物，回收纯化后进行TA克隆，经菌液PCR鉴定后选取阳性克隆送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序验证。所用引物序列见表1。

表1 基因克隆和定量引物信息Table 1 Information of the primers used for gene cloning and qRT-PCR

1.2.2 生物信息学分析 参照郝向阳等［26］的方法分析和预测GjPALs蛋白理化性质、保守结构域、二级结构、跨膜结构、磷酸化位点、信号肽和亚细胞定位情况。分别使用在线网站MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）、COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form. html） 和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析GjPALs保守基序、卷曲螺旋结构和三维结构。从NCBI数据库中检索并下载其他物种PAL氨基酸序列，采用MEGA6.0邻接法（neighbor-joining method）在默认参数下构建系统进化树。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析 采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removel）试剂盒（全式金）合成cDNA。以稀释50倍的cDNA为模板，以非洲菊18S rRNA为内参基因进行实时荧光定量。qRTPCR反应体系为SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）荧光染料10 μL、ddH2O 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL和模板1 μL。使用Excel 2003和SPSS 17.0进行数据统计和显著性分析。

2 结果

2.1 GjPALs基因克隆结果

利用RACE-PCR成功克隆获得GjPAL1 cDNA 3′端（899 bp）和5′端（540 bp）序列及GjPAL4 cDNA 3′端序列（682 bp）（图1）。利用RT-PCR对4个GjPALs进行克隆验证，均获得预期长度的片段（图1），说明成功克隆获得这4个基因。GjPAL1-GjPAL4（GenBank登 录 号 分 别 为MH708524、MH708525、MH708526和MH708527）CDS长度分别为2 127、2 115、2 136和2 127 bp，预测可分别编码包含708、704、711和708个氨基酸的蛋白。

图1 PCR产物电泳图Fig. 1 Electrophoresis result of PCR products

2.2 GjPALs生物信息学分析结果

蛋白基本理化性质分析结果显示，4个GjPAL均属于稳定的酸性亲水蛋白（表2）。结构域预测结果显示，4个GjPALs都包含保守的PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic和PAL-HAL结构域，均属于Lyase_I_Like超家族。其中，GjPAL1、GjPAL2和GjPAL4还含有特异性HutH结构域，GjPAL3含有非特异性HutH结构域（图2）。保守基序预测结果显示，在可信范围（e-value≤e-5）内，4个GjPAL蛋白均 含有16个Motif（图2）。多重序列比对结果显示：4个GjPALs间的相似性较高（均大于89%）且与其他物种PALs同源性较高（图3）。除GjPAL2外，所有GjPALs均含有GTITASGDLVPLSYIAG酶活性中心序列和植物PAL最典型的保守区域ASG（图3）。

图2 GjPAL1-GjPAL4（A-D）蛋白保守结构域和motif（E）分析Fig. 2 Conserved domains (A-D) and motifs (E) of GjPAL1-4

图3 不同植物PAL氨基酸序列的多重序列比对Fig. 3 Multiple alignment result of PALs from different plant species

表2 4个GjPALs蛋白基本理化性质分析结果Table 2 Physicochemical properties of the four GjPALs

蛋白二级结构预测结果（图4）显示，GjPALs均主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。SWISS-MODEL同源建模结果显示，它们与欧芹（Petroselinum crispum）PAL1三级结构相似性分别达86.63%、82.78%、82.12%和86.34%。COILS预 测 结 果 显示，仅GjPAL2和GjPAL3能形成卷曲螺旋结构。TMPRED分析结果显示，所有GjPALs均含有由内向外和由外向内的跨膜螺旋结构。磷酸化位点预测结果（表3）显示：GjPAL1-GjPAL4分别含有61、61、62和63个磷酸化位点。此外，信号肽和亚细胞定位预测结果表明，4个GjPALs均不含信号肽，且主要定位在细胞质。

表3 GjPAL跨膜结构域及磷酸化修饰位点分析结果Table 3 Result of transmembrane structure and phospho-rylation sites in GjPALs

图4 4个GjPALs三维结构的预测Fig. 4 Predicted four-dimensional structures of the four GjPALs

2.3 系统进化分析结果

将GjPALs与其他植物PAL蛋白构建进化树，发现植物PAL大致可分为双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和蕨类植物四类（图5）。除少数特例外（白桦是双子叶植物，但其PAL与蕨类植物聚为一类），PALs聚类结果基本与植物分类结果相符［27］。GjPAL1、GjPAL3和GjPAL4与菊科的莴苣PAL聚在一起，GjPAL2和其他双子叶植物PALs聚为一类。

图5 GjPALs和其他植物PALs系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree for GjPALs and PALs from some other plant species

2.4 实时荧光定量PCR分析

2.4.1 GjPALs在不同组织部位的表达分析 qRTPCR结果显示和GjPALs在叶柄中的表达量最低，除GjPAL1在叶中表达量最高外，其余3个GjPALs均在根中表达量最高（图6-A）。其中，GjPAL2和GjPAL3在根中表达量极高，分别约为叶中的70倍和130倍。

2.4.2 GjPALs在不同逆境条件下的表达分析 SA处理后，GjPAL1和GjPAL2的表达受到极显著抑制（P<0.01），而GjPAL3和GjPAL4的表达则呈先升后降的趋势。GjPAL3在SA处理4和8 h的表达水平极显著高于对照（P<0.01），分别约为未处理对照的3.8倍和2.3倍，SA处理12 h时显著低于对照（P<0.05），24 h时极显著低于对照（P<0.01）。GjPAL4在SA处理4 h时的表达量极显著高于对照（P<0.01），约为未处理对照的2.9倍，之后均极显著低于对照（P<0.01）（图6-B）。

盐胁迫处理条件下，GjPAL1、GjPAL2和GjPAL4的表达受到极显著抑制（P<0.01）。而GjPAL3的表达受到极显著诱导（P<0.01），在NaCl处理4、8、12、24和48 h的表达量分别约为对照的3.3倍、3.2倍、2.7倍、2.6倍和3.7倍（图6-C）。

PEG处理条件下，4个GjPALs的表达模式差异较大。GjPAL1和GjPAL2在PEG处理后均表现出降-升-降-升的表达模式，GjPAL1在处理后3 h的表达量有所回升，但依然极显著低于对照（P<0.01），而GjPAL2在处理后12 h的表达量达到最高值，且极显著高于对照（P<0.01）；GjPAL3在处理后呈现先升后降的趋势，且均高于对照，在处理0.5 h时表达量略高于对照，约为对照的1.2倍，1 h显著高于对照（P<0.05），约为对照的1.3倍，之后均极显著高于对照（P<0.01），分别约为对照的1.7倍、1.9倍、2.2倍和1.5倍；GjPAL4在PEG处理后表现出先降后升的趋势，但均极显著低于对照（P<0.01）（图6-D）。

4℃低温处理后，GjPAL1、GjPAL3与GjPAL4的表达均呈现先降后升的趋势，且均极显著低于对照；GjPAL2则表现出降-升-降的表达模式，在低温处理在4和24 h的表达量显著低于对照（P<0.05），8和12 h的表达量与对照相差不大（图6-E）。

隐地疫霉处理下，4个GjPALs的表达模式各不相同。GjPAL1的表达呈现升-降-升的趋势，且均极显著高于对照（P<0.01），接种隐地疫霉2、4和6 d后，表达量分别约为对照的3.5倍、2.4倍和4.0倍；与PjPAL1表达趋势相反，PjPAL2在接种隐地疫 霉后呈“降-升-降”的表达趋势，且均低于对照， 在2和6 d时的表达量极显著低于对照（P<0.01），分别仅为对照的59.6%和31.3%；GjPAL3在接种隐地疫霉后呈先降后升的表达趋势，在2 d时的表达量仅约为对照的39.0%，在4和6 d时的表达量分别约为对照的2.4倍和2.6倍；GjPAL4的表达受隐地疫霉接种诱导，在2 d时略高于对照，约为对照的1.2倍，4 d和6 d时极显著高于对照，分别约为对照的2.0倍和1.9倍（图6-F）。

图6 GjPAL基因在不同组织部位和不同逆境处理下的表达情况Fig.6 Relative expression of GjPAL genes in different tissues and organs and under different stress treatments

3 讨论

3.1 4个GjPALs序列相似度较高，但蛋白结构域、典型保守区域和结构存在一定差异

本研究基于前期非洲菊转录组数据［25］，利用RACE和RT-PCR技术成功克隆获得4个非洲菊PAL基因（GjPAL1-GjPAL4）。生物信息学分析结果显示，4个GjPALs编码的蛋白均属于Lyase_I_Like超家族，它们与其他植物PAL相似度较高，说明植物PAL在进化上相对保守［28］。4个GjPALs在结构域和保守区域上存在差异：GjPAL3含有非特异性HutH结构域外，而其他3个成员均含有特异性HutH结构域，而GjPAL2上不存在植物PAL最典型的保守区域ASG［7］。此外，4个GjPALs成员编码的蛋白中仅GjPAL2和GjPAL3能形成卷曲螺旋结构。以上结果暗示GjPAL2和GjPAL3与另外2个成员的功能可能差异较大。

3.2 不同GjPALs成员在不同组织部位和不同逆境处理下的表达特性差异较大

植物PAL基因在不同组织部位中的表达水平差异较大，且大多数植物PAL基因在根部表达量较高，茎中表达水平中等，在成熟的叶片中几乎不表达［7］。本研究发现GjPAL2-GjPAL4均在根中的表达量最高，推测它们可能在根系木质素合成调控中发挥重要作用［29-30］。丹参PAL1在叶中的表达量最高，而在茎和根中的表达量较低，且其表达受ABA、伤害和脱水等逆境处理诱导显著［31］。本研究却发现：在叶中表达量最高的GjPAL1，其表达量受SA、盐、干旱和低温的显著抑制，但其在根中的表达却受隐地疫霉显著诱导，说明不同植物的PAL基因功能不同。

通过研究GjPALs在不同逆境处理下的表达情况，发现GjPAL1和GjPAL4在不同逆境处理下的表达趋势更为相似（均受盐、干旱和低温抑制，且均受隐地疫霉诱导），与GjPAL2和GjPAL3相差较大。Shang等［32］研究发现黄瓜CsPAL7的表达受干旱诱导，整体呈现先升后降的变化趋势，与GjPAL3的表达趋势类似。本研究还发现在干旱胁迫下，GjPAL1和GjPAL4的表达受到极显著抑制；GjPAL2在PEG模拟干旱处理下表现为降-升-降-升的表达趋势，处理早期的表达也受到显著抑制，但在PEG处理12 h时的表达量已显著高于对照，说明GjPAL2和GjPAL3可能在非洲菊干旱胁迫应答过程中发挥更为重要的作用。盐胁迫处理下，GjPAL3的表达受显著诱导，而其他成员的表达受到显著抑制，说明GjPAL3还在非洲菊抵御盐胁迫过程中发挥重要作用。孙梓健等［33］研究指出红叶芥PAL在低温处理下整体呈现降-升-降的表达趋势，本研究发现GjPAL1、GjPAL3和GjPAL4在低温处理下均呈先降后升的表达趋势，而低GjPAL2呈降-升-降的表达模式，在低温处理8和12 h时的表达量已经恢复到对照相近水平，说明GjPALs在非洲菊的低温应答过程均发挥作用，其中GjPAL2的响应时间最早。

PAL在植物抗病防御反应中发挥着重要作用，因此，常被用作评价植物抗病能力的重要生化指标［28，34］。过表达PAL的转基因烟草对烟草尾孢病原菌抗性显著提高［35］；过表达PAL的莲藕转基因植株根瘤菌侵染速度延缓，结节数减少［36］；拟南芥PAL1/PAL2/PAL3/PAL4敲除突变体对细菌性病原菌（Pseudomonas syringae）的敏感性增加［2］。本研究除GjPAL2外，其余3个GjPALs接种隐地疫霉4和6 d的根系中的表达量均极显著高于对照，说明它们参与非洲菊-隐地疫霉互作。

综上所述，4个GjPALs均参与非洲菊对不同逆境的应答过程，但各成员在不同组织部位和在不同逆境处理下的作用存在一定差异。其中，GjPAL1和GjPAL4虽然在不同组织部位中的表达情况相差较大，但在不同逆境下的表达模式更为相近。

4 结论

本研究成功克隆获得4个非洲菊PAL基因（GjPAL1-GjPAL4），它们的CDS长度为2 115-2 136 bp，编码蛋白含704-711个氨基酸，为不含信号肽的稳定酸性亲水蛋白。GjPALs含有跨膜螺旋结构且主要定位在细胞质。

GjPAL1在叶中表达量最高，其他均在根中表达量最高；4个GjPALs的表达均受低温处理显著抑制；GjPAL1和GjPAL2的表达受SA、NaCl和PEG抑制显著；GjPAL3受NaCl和PEG处理显著诱导；隐地疫霉处理条件下，GjPAL1和GjPAL4的表达显著升高，GjPAL2显著降低。GjPALs在非洲菊抵御逆境过程中发挥着重要作用。