右美托咪定通过调控SIGIRR/NF-κB信号对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的影响

王鹏程，王 震，代彦文，王 涛

(1. 黄淮学院直属附属驻马店市中心医院麻醉科，河南 驻马店 463003；2.郑州大学药学院药理学系，河南 郑州 450001)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床上常见的急危重症之一，其死亡率一直居高不下。研究证实ALI危害主要是由于机体炎症反应失衡引起肺组织破坏，主要表现为各组炎症细胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α等)的释放增多，炎症细胞因子过量释放诱导的炎症级联反应进而加重肺组织损伤[1]。因此，通过有效的处理措施降低并抑制炎症风暴可能是预防和治疗ALI的有效措施，但是目前有关其特异性炎症治疗仍然缺乏。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)被认为是固有免疫系统中炎症反应的主要受体之一，TLR信号通路的过度激活是诱发机体炎症失衡的重要机制[2-3]。

单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(single immunoglobulin interleukin-1 receptor related protein，SIGIRR)是近期新发现的TLR超家族成员之一，是TLR信号传导中的负性调控分子[4]。既往研究发现，SIGIRR主要在肺泡及气道上皮细胞中高表达，LPS诱导的小鼠ALI肺组织SIGIRR表达下调[5]。过表达SIGIRR可以抑制LPS诱发的肺泡上皮细胞TLR4信号传导，继而减轻炎症反应，发挥肺泡上皮细胞的保护作用[6]。以上研究均表明，SIGIRR在ALI的炎症级联反应中发挥重要调控作用。因此，通过调节SIGIRR的表达对改善LPS诱导的ALI具有重要意义。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是临床上常用的一种催眠、镇静以及镇痛的麻醉药物，其作为肾上腺素能受体的选择性激动剂，有文献研究证实DEX能够减轻LPS诱导的大鼠急性肺和肾损伤[7]。另外，DEX能够通过降低TLR4表达，抑制NF-κB信号通路的活化，进而减轻LPS诱导的ALI肺损伤和炎症反应[8]。但是有关DEX对大鼠ALI肺损伤的分子作用机制尚不完全清楚。因此，该研究拟通过建立LPS诱导大鼠ALI模型，初步揭示DEX对LPS诱导大鼠ALI肺损伤的影响及其保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级，♂，4-6周龄，SD大鼠，体质量(200±20)g，购买于中国科学院实验动物研究所，许可证号：SCXK(京)2019-0010，适应性喂养1周，自由饮水，昼夜交替光照，温度维持在(20-25)℃，相对湿度60%-70%。

1.1.2实验试剂与仪器 胎牛血清和细胞培养基购买于Gibco公司，SIGIRR小鼠单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，货号：8242)，NF-κB兔单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，货号：59674)；p-NF-κB兔单克隆抗体(Abcam公司，货号：3786)，β-actin小鼠单克隆抗体(碧云天生物技术公司，货号：AF5001)，山羊抗兔二抗(碧云天生物技术公司，货号：A0409)，山羊抗小鼠二抗(碧云天生物技术公司，货号：A0413)，Western blot一抗稀释液(江苏碧云天生物技术公司，货号：P0256)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术公司，货号：P0011)，ECL发光液(江苏碧云天生物技术公司，货号：P0018FS)，酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒(北京中杉金桥公司)，蛋白质凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司，型号：ND11-GIS-300)，多功能酶标仪(美国 Bio-Tek公司，型号：SuPerMax 3100)，荧光显微镜(日本Olympus公司，型号：BX53)，高速冷冻离心机(湖南湘仪公司，型号：H2500R2)。

1.2 方法

1.2.1动物模型构建与分组 实验前大鼠禁食12 h，期间自由饮水。实验选取40只SD大鼠，每组各10只，并随机分为正常对照组(Control)、DEX对照组(DEX)、LPS诱导的大鼠ALI模型组(LPS)以及LPS+DEX处理组(LPS+DEX)。其中对于LPS组和LPS+DEX组大鼠采用腹腔注射LPS(5 mg·kg-1)构建ALI大鼠损伤模型，Control组和DEX组大鼠给予等量的0.9%的氯化钠注射。在DEX预处理实验中(DEX组和LPS+DEX组)，应在LPS大鼠腹腔注射前1 h均给予DEX(25 μg·kg-1)大鼠腹腔注射。实验各组大鼠在确证LPS诱导ALI大鼠损伤模型构建成功后，采用戊巴比妥钠麻醉大鼠并对各组大鼠肺组织进行病理学取材，检测。

1.2.2各组大鼠肺湿/干质量比(W/D)检测 大鼠麻醉后，取出右肺中叶组织，快速利用PBS缓冲溶液冲洗组织表面的血液之后采用滤纸吸干组织表面的水分，称取肺组织湿质量(W)，之后将各组湿肺组织放置于75 ℃的恒温烤箱中进行时长12 h的烘烤，待烘干至质量不变后测定肺组织干质量(D)。

1.2.3苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色观察肺组织形态学改变 采用4%的多聚甲醛固定大鼠右肺组织，石蜡包埋、病理学切片(5 μm)，按照HE染色规范操作步骤进行HE病理学染色。

1.2.4ELISA检测各组大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-1β、IL-6和TNF-α含量 分离大鼠气管并夹闭右侧肺支气管，结扎肺门，将事先预冷的PBS从大鼠左侧支气管中进行肺泡灌洗，收集左支气管肺泡灌洗液，于4 ℃条件下，12 000 r·min-1，离心10 min，取上清液，之后按照对应的ELISA检测试剂盒说明书进行测定。

1.2.5免疫组化检测各组大鼠右肺组织SIGIRR表达、NF-κB活化情况 将大鼠右肺组织的石蜡切片置于60 ℃烤箱内脱蜡，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脱水。将右肺组织切片置于10 nmol·L-1的柠檬酸盐缓冲溶液中，90 ℃抗原修复30 min。室温条件下，自然冷却并用去离子水缓慢冲洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封闭20 min。加入SIGIRR小鼠单克隆抗体和p-NF-κB兔单克隆抗体(工作液体积稀释比例为1 ∶200)，4 ℃条件下孵育过夜。加入对应山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗，室温条件下孵育30 min。滴加DAB显色液，显色后拍照，观察右肺组织中SIGIRR表达和NF-κB磷酸化水平。

1.2.6Western blot 检测各组大鼠右肺组织中SIGIRR、NF-κB表达 取各组大鼠右肺组织，PBS润洗1-2次，离心，加入细胞组织裂解液(体积比为1 ∶5)，冰上裂解1 h；4 ℃、12 000×g离心15 min，收集上清液，采用BCA法进行蛋白质浓度定量检测；然后取各组大鼠右肺组织总蛋白30 μg，上样至聚丙烯酰胺80 V凝胶电泳，80 V电泳30 min后，转120 V、电泳60 min。选取目的胶条，采用湿转转膜法将目的蛋白转移至PVDF膜上，转膜时长2 h，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育SIGIRR小鼠单克隆抗体(1 ∶1 000)，NF-κB兔单克隆抗体(1 ∶1 000)，p-NF-κB兔单克隆抗体(1 ∶1 000)以及β-actin小鼠单克隆抗体(1 ∶2 000)，4 ℃过夜，孵育对应的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)1-2 h；摇床摇晃上加TPBS洗涤3次，5 min/次，然后加入显影液，显影并拍照。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织W/D、IL-1β、IL-6和TNF-α比较与Control组相比，LPS处理组大鼠肺组织W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明显增加(P<0.01)，DEX组大鼠肺组织W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量差异差异无统计学意义(P>0.05)。与LPS处理组相比，LPS+DEX组肺组织W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)(Tab 1)。

Tab 1 Comparison of W/D in lung tissues and contents of IL-1β, IL-6 and TNF-α in BALF of rats in each group n=6)

2.2 各组大鼠肺组织病理学变化Control组和DEX组大鼠肺组织结构完整，肺泡腔轮廓光滑清晰，肺泡间隔无典型性的水肿现象，以及炎症细胞过度浸润等情况改变。LPS处理组大鼠肺组织出现明显的病理性损伤，肺泡结构出现严重的破坏，肺泡壁明显水肿，肺间质增厚并伴有大量的炎症细胞浸润。LPS+DEX组大鼠肺组织损伤程度减轻，但是肺泡结构有部分损坏，间质有少许炎症细胞浸润并伴有肺泡腔液体渗出等(Fig 1)。

Fig 1 Effect of DEX on histopathological changes of lung tissues in LPS induced ALI rats (×400)A：Control；B：DEX；C：LPS；D： LPS+DEX

2.3 DEX降低LPS诱导大鼠肺组织SIGIRR蛋白降解与Control组相比，LPS处理组大鼠肺组织中SIGIRR表达明显降低(P<0.01)，DEX组大鼠肺组织SIGIRR表达差异无统计学意义(P>0.05)。与LPS组相比，LPS+DEX组大鼠肺组织SIGIRR表达显著增加(P<0.01)(Fig 2)。

2.4 DEX抑制大鼠肺组织NF-κB磷酸化与Control组相比，LPS处理组大鼠肺组织NF-κB磷酸化活化增强(P<0.01)，DEX处理组大鼠肺组织NF-κB磷酸化活化差异无统计学意义(P>0.05)。与LPS组相比，LPS+DEX组大鼠肺组织NF-κB磷酸化活化降低(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 2 Effect of DEX on expression of SIGIRR of lung tissues in LPS induced ALI rats n=6)

Fig 3 Effect of DEX on expression of NF-κB of lung tissues in LPS induced ALI rats n=6)

3 讨论

ALI具有高发病率和高死亡率，是一种常见的肺部疾病，也是急性呼吸衰竭重要危险因素。炎症细胞因子过度激活以及促炎介质的过量产生是导致ALI发生发展的关键因素。其中炎症性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α在ALI中发挥重要作用[9]。研究发现，IL-1β能够通过改变肺泡上皮细胞和血管的通透性，诱发肺部水肿并最终导致ALI[10]。以上研究均表明，炎症反应的失衡是引发ALI的关键因素。因此，通过探寻药物有效调控炎症因子的释放对于改善ALI诱发的肺损伤具有重要作用。DEX临床上具有镇静、镇痛、催眠，对呼吸作用几乎无抑制作用等特点。新近研究发现，DEX能够通过调节机体免疫功能、降低炎症细胞因子表达，缓解炎症反应等作用[11]。在脓毒症患者中，DEX能够降低患者血清中炎症因子水平，缓解机体炎症[12]。另外，有研究报道DEX能够减轻脓毒症大鼠肺水肿程度，其可能通过降低炎症反应和氧化应激[13]。

SIGIRR基因是位于11号染色体，p15.5号条带上，其编码的蛋白质具有Ig细胞外结构域，跨膜结构域，细胞内TIR结构域以及胞内尾区组成[4]。既往文献显示SIGIRR在组织中广泛表达，主要包括肾脏、消化道、肝脏以及肺组织等，广泛参与了炎症、肿瘤相关炎症和自身免疫性疾病[14]。既往研究发现，在LPS刺激的肺泡上皮细胞中SIGIRR蛋白表达下调[5]。过表达SIGIRR能够抑制HMGB1诱导的A549细胞炎症因子TNF-α和IL-1β，缓解ALI大鼠肺部损伤[15]。本研究首先通过大鼠腹腔注射LPS构建ALI模型，探究DEX对ALI肺部损伤的作用机制。结果显示，与Control组相比，LPS处理组大鼠肺组织W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明显增加，DEX组大鼠肺组织W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量无明显变化。病理学染色显示Control组和DEX组大鼠肺组织结构无明显改变，结构完整，肺泡腔轮廓清晰，肺泡间隔无明显水肿以及炎症细胞浸润等情况改变。LPS处理组大鼠肺组织出典型的病理学改变，以上结果表明ALI模型构建成功。与LPS处理组相比，LPS+DEX组肺组织W/D以及BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明显降低，病理损伤减轻，表明DEX能够通过降低肺部炎症反应，缓解LPS诱导的ALI肺部损伤。为进一步探究DEX对LPS诱导ALI的作机制涉及SIGIRR基因。本研究通过免疫组化和Western blot检测各组大鼠肺组织SIGIRR蛋白表达，结果显示，与Control组相比，LPS处理组大鼠肺组织中SIGIRR表达明显降低，DEX组大鼠肺组织SIGIRR表达差异无统计学意义。与LPS组相比，LPS+DEX组大鼠肺组织SIGIRR表达明显增加，表明DEX可能通过降低LPS诱导SIGIRR降解，降低IL-1β、IL-6和TNF-α，进而缓解ALI肺损伤。NF-κB被研究证实作为炎症反应中心成员之一，能够激活炎症细胞因子。既往研究过表达SIGIRR可以抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞NF-κB活化，降低炎症反应，从而诱发肺泡保护作用[16]。而在本实验中我们发现LPS组大鼠肺组织NF-κB活化增加，LPS+DEX组肺组织NF-κB活化降低。TLR信号触发后，可以通过MyD88依赖性途径和MyD88肺依赖性途径激活NF-κB。

综上所述，DEX能够降低IL-1β、IL-6和TNF-α表达，抑制炎症反应，从而缓解ALI肺损伤，其机制可能与降低LPS诱导SIGIRR降解，从而抑制NF-κB转录活性有关。