基于网络药理学研究人参防治创伤性应激障碍药效成分及作用靶点

王中立，干丽君，刘秀秀，李秀丽，易本谊

(九江学院护理学院，江西 九江 332000)

创伤性应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)指经历超出承受能力的应激事件后，出现以对相似应激敏感性增高、睡梦回顾应激事件和焦虑为主要临床表现的神经精神疾病。由于社会生活模式转变，生活工作压力增加，应激事件暴露机率增高，同时医疗系统对神经精神疾病的重视及诊断标准的进步，临床上PTSD的发病人数逐年增多[1]。据世界卫生组织统计，全球10%的人口经历过足以导致PTSD发病的应激事件，其中60%的应激事件经历者最终发展成为PTSD患者，一旦发病预后极差[2]。

PTSD的治疗目前临床主要采用心理疏导联合药物治疗的方式，而临床疗效不能令人满意，尤其在药物治疗领域。目前，治疗PTSD的药物中仅5-羟色胺再摄取抑制药物被美国食品药品监督管理局认可，然而通过大数据分析得到疗效不确切的结论[3]。因此，寻找治疗PTSD的有效药物成为医药工作者一项重要的研究任务。

中医学虽未有“创伤性应激障碍”之病名，根据其临床特征可将其归属于情志病范畴。中医药治疗情志病具有自身的特点和优势。临床前研究通过对治疗情志病常用中药进行筛选实验发现了补气类中药防治PTSD的有效性，其中代表药物为人参[4]。为了进一步深入研究人参发挥药理作用的机制，从而更好的应用于临床治疗当中，本文应用网络药理学方法对人参有效成分、作用靶点以及可调控的病理生理过程进行研究分析，为实证人参防治PTSD的研究提供线索和依据。

1 材料与方法

1.1 数据资料人参成分数据来源于TCMSP数据分析平台(http://tcmspw.com/index.php)，并根据中药药理学研究规范筛选潜在的有效成分作为研究对象[5]。筛选主要通过生物利用度和类药性两个指标进行，从而确定本研究的药用成分(具体见研究结果1)。根据药物成分获得药物的作用靶点信息，该数据同样来源于TCMSP平台。创伤性应激障碍相关基因数据来源于Gene Card(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)数据库。将两数据库结果综合去重后获得疾病相关基因。

1.2 研究方法分析获得人参有效成分中最有利于作为药物应用的有效成分，筛选条件为生物利用度≥30%，类药性≥0.18。根据所筛选有效成分于数据库中下载相应作用位点。药物作用位点与疾病相关基因做交集获得药物治疗疾病潜在的作用靶点。分别对药物治疗疾病的作用靶点进行网络互作分析(PPI)、基因本体论富集分析(GO)和信号通路富集分析(KEGG)，从而获得潜在作用靶点中的核心靶点(对于功能的影响权重最大，处于PPI网络中心)，了解靶点基因的主要生物学功能以及通过什么途径发挥具体的生物学作用。

1.3 统计学处理基因注释、分类及取交集应用Perl计算机语言完成。药物成分-疾病相关基因网络图应用cytoscape软件完成。蛋白质互作网络研究通过STRING(https://string-db.org/)。基因本体论富集分析、信号通路富集分析应用R计算机语言完成。

2 结果

2.1 人参有效成分、作用靶点及疾病相关基因检索根据研究方法中的筛选规则对人参有效成分进行收集整理，数据来源TCMSP平台，具体纳入研究成分见Tab 1。药物作用靶点及PTSD发病相关基因的具体内容由数据库平台提供。

Tab 1 Overview of bioavailability and medicinal propertiesof ginseng components included in study

2.2 人参防治PTSD作用靶点预测人参药用成分作用位点与PTSD发病相关基因做交集获得人参防治PTSD作用靶点。共得到16个相交的基因，如Fig 2,分别是ADRB2、NR3C2、SLC6A2、SLC6A3、MAOB、MAOA、SLC6A4、OPRM1、PRKCA、HTR3A、NOS2、ACHE、HMOX1、IL1B、IFNG、ADCYAP1。

Fig 1 Network pharmacological analysis of targets of ginseng inprevention and treatment of traumatic stress disorder

Fig 2 Venn map of ginseng target for preventing PTSD

2.3 人参作用靶点与PTSD相关基因网络关系通过药物靶点与疾病相关基因的相交所获得的信息，反向得到人参防治PTSD的有效成分，即药物成分的作用位点与疾病相关基因相重合，这样就形成了药物成分-成分靶点-疾病基因的网络调控信息。根据研究方法中的预设条件共得到11种人参的药用成分与PTSD发病密切相关的16个基因(见结果2.2)具有药物靶点相互作用关系。11种人参药用成分包括高丽槐素、吉九里香碱、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rh2、灌木远志酮A、邻苯二甲酸二异辛酯、脱氧三尖杉酯碱、β-谷甾醇、阿朴天仙子碱、豆甾醇和山奈酚。

2.4 人参药物成分防治PTSD作用靶点相互作用分析根据人参防治PTSD靶点基因获得所对应的编码蛋白，应用String软件进行蛋白质相互作用分析，得到靶点蛋白之间的相互关系，同时分析获得核心基因即网络最中心的蛋白质(与其他蛋白质作用最广泛，node值最大)，见Fig 3。

Fig 3 Results of PPI network analysis of targetsof ginseng in prevention and treatment of PTSD

2.5 人参药物成分防治PTSD作用靶点基因本体论富集分析应用GO富集分析的方法探讨人参防治PTSD靶点基因在生理功能的富集情况，具有显著统计学意义的前10位GO功能如Tab 2和Fig 4。结果显示：靶点基因主要富集在离子通道和神经递质两大功能上。

Tab 2 Enrichment analysis of target genes ofginseng for prevention and treatment of PTSD

Fig 4 Results of GO enrichment analysis of targetsof ginseng in prevention and treatment of PTSD

2.6 人参药物成分防治PTSD作用靶点基因信号通路富集分析应用KEGG信号通路富集分析的方法探讨人参防治PTSD靶点基因富集在那些信号通路上发挥作用，具有显著统计学意义的前10位KEGG信号通路如Tab 3和Fig 5。结果显示：靶点基因主要富集在单胺类神经递质和突触囊泡转运相关的信号通路上。

Fig 5 Results of KEGG enrichment analysis oftargets of ginseng in prevention and treatment of PTSD

Tab 3 Enrichment analysis of KEGG pathway ofginseng target for prevention and treatment of PTSD

3 讨论

随着大数据时代的到来，生物信息学被运用于生物医学研究领域中是一个必然的趋势，体现在中药的研究中就是网络药理学。本研究应用网络药理学对人参防治PTSD的药物有效成分及靶点进行了研究。研究结果显示，人参所包含的11种有效成分分别作用于16个与PTSD发病密切相关的靶点基因，具有潜在的预防和治疗PTSD的作用。进一步对16个靶点基因进行生物功能(GO)和信号通路(KEGG)分析，了解到人参通过调节5-羟色胺能突触、儿茶酚胺能突触和突触小泡转运功能等途径发挥防治PTSD的药理学作用。其中最为关键的基因通过蛋白质互作网络(PPI)被发现，分别是5-羟色胺受体3A、单胺氧化酶A、肾上腺受体β2受体处于PPI网络核心部位，可以作为重要靶点基因进行验证研究。从人参有效药用成分角度出发，研究结果显示：人参有效成分中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、山奈酚(kaempferol)、阿朴天仙子碱(aposiopolamine)对神经递质(包括5-羟色胺和单胺类神经递质)的转运、中枢神经系统内水平及相对应的受体具有调节作用。而吉九里香碱(girinimbin)、邻苯二甲酸二异辛酯(diop)和灌木远志酮 A(frutinone A)在PTSD的防治过程中主要通过作用于β2肾上腺素能受体发挥作用。因此，人参可以通过调控单胺类神经递质代谢，改变相关受体活性发挥防治PTSD的药理学作用。

关于人参预防和治疗神经精神疾病的临床前研究近年来被广泛报道，其中也包括人参防治PTSD的文献报道[6-8]。本课题组前期工作在C57BL/6N小鼠上发现人参水煎液可以逆转由高皮质酮血症导致的行为异常，并进一步研究发现这一药理作用可能通过神经可塑性机制发挥作用，如兴奋性氨基酸转运、突触可塑性、胶质细胞功能异常等[9-10]。Gao等[11]应用人参有效成分人参皂苷Rg2在动物实验中获得了相同的研究结果。以上临床前研究与本文所获得的研究结果相一致，都反映了人参具有防治PTSD的药理作用，并且PTSD发病与神经递质和突触功能异常相关。临床研究中通过对PTSD患者的辨证论治发现，有相当一部分患者表现为本虚标实，尤其对于患病时间较久的患者心胆气虚和“恐伤肾”导致的肾气虚为主要证型，临床治疗中采用补气类中药进行治疗取得较好的治疗效果[12-15]。通过本次网络药理学研究能够为其提供现代药理学基础数据的支持。

本研究的意义在于：首先，研究结果从另一角度证实人参具有防治PTSD的药理作用；其次，能够解释人参防治PTSD的不同机制出现的原因，是由于多成分多靶点所造成。最后，通过药物靶点基因的综合分析获得了PTSD相关病理生理机制的信息，从这一角度出发可以进一步阐述PTSD发生发展的神经生物学机制，这也是神经药理学重要的工作之一。然而，基于目前已知人参防治PTSD的文献，本次网络药理学研究结果并没有涵盖所有已经被报道的人参药用成分与作用靶点。造成这一情况的原因：一方面由于药物成分入选的条件是根据中药药理学通行的研究经验进行主观设定与真实情况存在一定差异，可能导致具有潜在良好药效的成分未入选。另一方面，大量相关研究仅仅停留在改善PTSD模型动物功能表型这一水平，而没有涉及到作用靶点这一药理学关键问题。因此，本研究的结果可能随着相关数据库的不断完善和研究方法的不但进步发生变化。网络药理学研究方法本质上是基于数据库对已有研究的总结归纳以及对具有潜在研究意义的工作预测，所以研究得到预测结果必须通过科学的实验设计进行验证。

综上所述，本研究结果为进一步研究人参防治PTSD提供了依据和方向，尤其对人参有效成分治疗本病的研究提供了备选成分和药物靶标，两者相结合进行实验验证可能获得有意义的科学成果。