解淀粉芽胞杆菌生物多聚物合成与应用研究进展

王世伟， 王卿惠, 蒋 浩， 李婷婷， 周智博， 王 韬， 张婉琪， 朱研文

(1.齐齐哈尔大学生命与农林学院 抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161005； 2．东北农业大学 生命科学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)属革兰阳性菌，广泛分布于自然界。在生长过程中其自身能产生多种酶[1]，决定了其代谢产物的多样性。目前，研究较多的是解淀粉芽胞杆菌所产抑菌活性物质，包括伊枯草菌素(iturin)、芬荠素(fengycin)、表面活性素(surfactant)等。笔者已经对解淀粉芽胞杆菌抗真菌活性物进行了较全面综述(待发表)。随着研究深入，关于解淀粉芽胞杆菌生物多聚物(biopolymers)的研究报道逐渐增多，如γ-谷氨酸、胞外多糖、果糖均聚物、聚酮化合物等。本文结合最新国内外相关报道，就解淀粉芽胞杆菌产生的生物多聚物特点、合成、功能及应用进行归纳总结，为今后深入研究、开发和利用这些生物多聚物提供有价值的参考。

1 淀粉芽胞杆菌生物多聚物的结构、性质及其目前的应用

目前研究较多的解淀粉芽胞杆菌生物多聚物(biopolymers)主要包括γ-聚谷氨酸、胞外多糖、果糖均聚物、聚酮化合物等。这些多聚物的优良特性决定了其潜在应用价值。表1归纳了解淀粉芽胞杆菌重要生物多聚物的性质和应用。其中重点归纳了聚-γ-谷氨酸在农业、保健品、化妆品、医药品等领域的应用。

表1 解淀粉芽胞杆菌产生重要生物多聚物及应用

解淀粉芽胞杆菌产生的胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)也有重要的研究价值。随着人们对糖基化修饰作用认识的深入以及糖类分析技术的改善，糖类研究正成为生命科学研究中又一新前沿。解淀粉芽胞杆菌所产胞外多糖在结构、性能及生产方面具有独特优势，优良流变学特性和生物安全性已广泛应用于调剖剂、食品添加剂、医药品、絮凝剂等诸多领域[16-17]。

解淀粉芽胞杆菌产生的聚酮类化合物具有抗生素、抗真菌素、细胞抑制剂(cytostatic)和天然杀虫剂功效。微生物聚酮数量庞大，结构和生物活性具有多样化特性，已经成为新药开发的重要来源。解淀粉芽胞杆菌产生次生多聚物有着广泛应用前景，深入研究其性质和特性具有重要意义。

2 解淀粉芽胞杆菌产生的聚-γ-谷氨酸

聚-γ-谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid，PGA)的优良特性决定了其应用的广泛性。多年来人们从不同的角度来提高聚-γ-谷氨酸产量，目前解淀粉芽胞杆菌聚-γ-谷氨酸产量在不断提高。

2.1 聚-γ-谷氨酸研究及其微生物菌种来源

聚-γ-谷氨酸是微生物发酵合成的水溶性多聚氨基酸，以左、右旋光性谷氨酸为单元体，以γ-位上的醯胺键聚合而成。长期以来人们对其性质、产生菌改良和基因特性以及发酵过程和提取纯化进行了大量研究。近几年来，因利用环境友好材料和改善环境的迫切需求，推动了聚谷氨酸产业化研究进程，使PGA生产和应用研究成为热点。从产生菌研究方面看，产PGA细菌多为芽胞杆菌，例如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、纳豆芽胞杆菌(Bacillusnatto)和地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、暹罗芽胞杆菌(Bacillussiamensis)、亚洲嗜盐碱杆菌(Natrialbaasiatica)、炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)。除此之外，一些球菌，包括嗜盐球菌(Planococcushalophilus)、表皮葡萄球菌(Saphylococcusepidermidis)、盐藻芽胞八叠球菌(Sporosarcinahalophila)[18]也产聚-γ-谷氨酸。刘润泽等[19]最近从黑龙江北大仓酒大曲分离鉴定的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)M1-1也具有产PGA能力，提高其产量具有潜在应用价值。解淀粉芽胞杆菌产生的PGA对人体和环境无毒，具有生物降解性，对生态友好。因此，提高解淀粉芽胞杆菌PGA合成能力具有极其重要的意义。

2.2 提高解淀粉芽胞杆菌聚-γ-谷氨酸(PGA)产量的策略

目前，人们已经对解淀粉芽胞杆菌PGA产量提高进行了大量的研究，取得了一些进展。其中一些重要的方法和策略值得借鉴。

2.2.1 添加前体物或底物提高PGA产量 为了研究菊粉(前体物)对解淀粉芽胞杆菌产PGA的影响，Qiu等[20]利用新型菌株NX-2s，分析了PGA合成酶基因(pgsb、pgsc、pgsa)、调控基因(comA、degQ、degS)和谷氨酸生物合成基因(glna)的转录水平。结果发现，前体物(菊粉)能上调这些关键基因表达。作为前体物的菊粉，不仅能调节终产物PGA合成酶基因的表达，同时也调节底物谷氨酸合成酶基因的转录水平，通过这种“双重”途径增加终产物PGA的合成能力。在没有外源谷氨酸情况下，菌株NX-2s在发酵过程中可产生(6.85±0.22) g/L的PGA；外源谷氨酸能显著提高分批发酵PGA产量，可见，底物(谷氨酸)是合成PGA的一个关键诱导物。通过前体物和底物的双重调节，促进解淀粉芽胞杆菌聚-γ-谷氨酸的合成。因此，为了使解淀粉芽胞杆菌合成更多的PGA，寻找一种合适的前体物是提高聚谷氨酸产量的关键。

2.2.2 消除内源性质粒增加PGA产量 解淀粉芽胞杆菌LL3是一种不依赖谷氨酸的PGA产生菌，由一个环形染色体和一个内源性质粒pMC1组成。Feng等[21]通过质粒不相容性原理，将推测的Rep蛋白基因(DNA解旋酶基因)和内源性质粒复制起点克隆到温度敏感载体中，产生不相容质粒pKSV7-rep-ori。经电穿孔转化菌株LL3，30 ℃ 孵育30代后发现，消除质粒的菌株能明显增加PGA产量。可见，消除解淀粉芽胞杆菌内源质粒，能有效增加PGA产量，其具体原因需要进一步研究。

2.2.3 删除相关基因提高PGA产量 Gao等[22]通过4个编码抗生素非标记基因簇(itu、bae、srf和fen)单标记或多标记缺失，构建了数个解淀粉芽胞杆菌LL3突变体。与野生型菌株相比，Δsrf突变体γ-PGA合成略有增加(4.1 g/L)；ΔituΔsrf突变体PGA产量从3.3 g/L增加到4.5 g/L(增加36.4%)。Zhang等[23]发现解淀粉芽胞杆菌LL3菌株的rocR、rocG和gudB基因产物能促进枯草芽胞杆菌谷氨酸盐向2-氧代谷氨酸盐的转化，基因odhA负责合成2-氧基戊二酸脱氢酶复合物的一个组分(该酶复合物能催化2-羟基戊二酸氧化脱羧为琥珀酰辅酶A)。在上述4个基因框架内进行了基因缺失实验。在摇瓶实验中，gudB/rocG双突变体的PGA产量比野生型提高38%。在5 L发酵罐中，rocR突变体PGA产量提高到5.83 g/L，gudB/rocG双突变体γ-PGA产量达5.68 g/L，比野生型提高了40%。可见，删除相关基因可以提高聚谷氨酸的产量。双基因删除突变要比单基因删除突变合成γ-PGA的效率更高。但目前具体的基因表达机制以及双突变比单突变如何更有效地提高γ-PGA合成能力的真正原因，尚有待进一步研究。

2.2.4 引入相关基因提高PGA产量 如表2所示解淀粉芽胞杆菌利用蔗糖的2种途径。其中在天然蔗糖利用途径中，ATP消耗较高，为非节能型；而蔗糖磷酸化酶途径，ATP消耗较少，为节能型途径。Feng等[24]删除解淀粉芽胞杆菌NK-1天然蔗糖利用途径，获得sacA、sacB和RBAM_03820等3个基因缺失的3Δ菌株，其中sacA和RBAM_03820基因均编码蔗糖-6-磷酸水解酶(sucrase-6-P hydrolase)；而sacB基因第2种水解蔗糖的酶，即蔗糖6果糖转移酶(levansucrase)。构建了4种异源节能蔗糖利用途径的组合，并将其引入到3Δ菌株中。结果发现将大肠埃希菌(Escherichiacoli)cscB基因 (编码蔗糖渗透酶)与青春期双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)sucP基因(编码蔗糖磷酸化酶)联合导入3Δ菌株获得的工程菌株，蔗糖代谢效率最高。在相同发酵条件下，相应突变体比NK-1菌株多消耗了49.4%的蔗糖，γ-PGA产量提高了38.5%。由此可知，引入异源节能型蔗糖利用途径的相关基因，能提高靶产物PGA的产量。这种新策略可以拓展到其他微生物利用蔗糖底物生产生化产品。一般认为，对于谷氨酸依赖型γ-PGA生产菌，提高细胞内谷氨酸合成能促进γ-PGA产量提高。将谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)谷氨酸合成的优良特性引入解淀粉芽胞杆菌，期望提高其γ-PGA的产量。Feng等[25]将谷氨酰胺杆菌独特的谷氨酸合成特性，引入到不依赖谷氨酸的解淀粉芽胞杆菌NK-1中。引入节能型NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶(NADPH-GDH)途径后，NK-1(pHT315-gdh)菌株PGA产量增加9.1%。在NK-1菌株中引入了一个优化的代谢切换开关，以控制α-酮戊二酸脱氢酶复合物(ODHC)表达，获得的NK-PO1(pHT01-xylR)菌株比NK-1菌株PGA产量提高66.2%。然而，将两个基因同时导入，获得的工程菌株PGA的产量却有所下降。从中可以看出，代谢网络是错综复杂的，基因不同组合并非一定能产生叠加效应。因此在引入不同基因时，要考虑不同基因的相互联系，不同策略组合要具体问题具体分析，找出其特有的规律性。

表2 解淀粉芽胞杆菌NK-1利用蔗糖的途径

2.2.5 代谢途径的合理设计提高聚-γ-谷氨酸合成能力 Feng等[26]利用代谢工程相关代谢网络，构建了1株解淀粉芽胞杆菌高产PGA菌株：其网络组成包括副产物合成→PGA降解→谷氨酸前体合成→PGA合成→自诱导物合成。首先从起始NK-1菌株中删除了参与副产物合成基因，获得的NK-E7菌株中，epsA-O基因(负责胞外多糖合成)、sac基因(负责果聚糖合成)、lps基因(负责脂多糖合成)和pta基因(编码磷酸转乙酰酶)已经被删除，NK-E7菌株合成的PGA纯度增加，浓度有所增加(从3.8 g/L提高到4.15 g/L)。可见，这些副产物，特别是相关多糖合成酶基因的删除，从一定程度上提高了PGA合成效率。删除编码PGA解聚酶基因(pgdS)和编码细胞壁水解酶基因(cwlO)，获得的NK-E10菌株的PGA产量从4.15 g/L增加到9.18 g/L。可见，删除解聚酶基因和细胞壁水解酶基因均可使工程菌株PGA合成增强，其原因可能是封闭了其代谢产物的流向，从而打开了工程菌株PGA合成通路。删除NK-E10菌株中的自诱导剂AI-2合成酶基因(luxS)的NK-E11菌株的PGA浓度与NK-E10却相当 (9.18～9.54 g/L)，几乎没有改善。说明自诱导剂合成酶对PGA的产量不起关键作用。在NK-E11株中，过表达编码PGA合成酶的pgsBCA基因反而导致PGA产量减少，这种现象有待进一步研究。在NK-E11菌株中表达合成小调节RNAs能明显抑制谷氨酸脱氢酶基因(rocG)和谷氨酰胺合成酶基因(glnA)表达。rocG基因受到抑制的NK-抗-rocG菌株PGA浓度最高(11.04 g/L)，比NK-1株高2.91倍。分批补料培养NK-抗-rocG菌株的γ-PGA浓度为20.3 g/L，比摇瓶培养的NK-1菌株高5.34倍。可见，这种代谢工程的网络是纵横交错、错综复杂的，在实践中探索提高PGA产量的方法，最终更加清晰地理清代谢网络代谢途径，从而发现未知途径。

从以上研究可以看出，提高解淀粉芽胞杆菌PGA产量的方法多种多样，包括添加前体物或底物、消除内源性质粒、消除或引入相关基因以及改变代谢途径。深入研究各相关基因、代谢途径和网络势必会增加PGA产量，并对解淀粉芽胞杆菌聚-γ-谷氨酸代谢网络的阐明具有重要意义。

3 解淀粉芽胞杆菌产生的多糖类物质研究

3.1 解淀粉芽胞杆菌产生的胞外多糖的研究

胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)是微生物分泌到细胞壁外并能分泌到环境中的水溶性多糖，属于次级代谢产物。目前对解淀粉芽胞杆菌胞外多糖研究，包括提高产量、优化纯化方法和改善性能等。

3.1.1 提高解淀粉芽胞杆菌胞外多糖产量 优化发酵条件提高胞外多糖的产量。张丽姣等[27]通过单因素和响应面实验，研究了解淀粉芽胞杆菌PB胞外多糖发酵条件，采用最优发酵培养基(g/L)：蔗糖400、酵母粉2.5、NaCl 10、pH 7.0。发酵条件：接种量4%(体积分数)、温度30 ℃、转速150 r/min、发酵时间26 h。胞外多糖产量高达104.37 g/L。可见，选择合适的培养基，优化发酵条件，可以有效提高解淀粉芽胞杆菌胞外多糖合成能力。

3.1.3 解淀粉芽胞杆菌胞外多糖基因的研究 韩玉竹等[30]从解淀粉芽胞杆菌 LPL061发酵液中获得了多糖粗品，并纯化了中性糖组分(EPS1)和酸性糖组分(EPS2)，根据GenBank中已报道芽胞杆菌产糖相关基因设计引物，经PCR 扩增获得解淀粉芽胞杆菌 LPL061基因组中，5个参与 EPS 合成的相关基因分别与多糖聚合、糖基转移、糖链长度控制以及多糖转运和输出相关。不但为后续功能和构效关系阐明奠定了基础，也为其胞外多糖生物合成途径和调控机制奠定了理论基础。可见，不同来源解淀粉芽胞杆菌胞外多糖结构不同，其所具有的功能特性也不相同。深入研究其多糖结构、单糖组成和比例、颗粒大小、形状差异等，能更好地理解其特性，如抗氧化性、乳化性能和免疫活性等。深入研究该菌胞外多糖结构和功能之间的相关性及其相关基因的结构和功能将是今后研究重点。从而使解淀粉芽胞杆菌胞外多糖得以更好地应用。

3.2 解淀粉芽胞杆菌产生的果糖均聚物

解淀粉芽胞杆菌除了能产生胞外多糖，还可合成果糖均聚物(Levan)。果糖均聚物是一类果聚糖，由大量果糖单元以β-(2,6)果糖苷键连接构成聚糖主链，并含有少量β-(2,1)果糖苷键连接的支链组成。部分微生物来源的Levan具有重要的生物活性，在医药和功能性食品方面具有巨大的应用潜能[31]。为提高解淀粉芽胞杆菌产Levan水平，Gu等[33]对解淀粉芽胞杆菌的编码果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)表达和转果聚糖合酶分泌的调控因子进行了优化，评估了4个异源表达sacB启动子。结果发现，启动子Pgrac导致sacB基因的转录和转果聚糖合酶活性达最高水平。相应重组菌株ΔLP-pHTPgrac的Levan产量达到30.5 g/L，比对照菌株NK-ΔLP高114%。可见，优化相关基因和调控因子，可增强果糖均聚物合成能力。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)是天然存在于脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌，具有益生作用。Cai等[33]研究发现解淀粉芽胞杆菌产生的果糖均聚物能提高罗伊氏乳杆菌对HT-29细胞的黏附能力，可能的机制是通过提高不饱和脂肪酸比例使乳杆菌克服排斥力，更容易接近肠上皮细胞。同时使细胞膜蛋白，如S层蛋白、伸长因子Tu和磷酸甘油酸激酶增加，从而增强了与上皮细胞受体的互补相互作用。结果表明，Levan可以作为一种潜在的益生素来调节益生菌的黏附能力，为开发特定益生菌功能食品提供基础。随着对果糖均聚物功能研究的深入，其应用前景必将十分广阔。

4 解淀粉芽胞杆菌产生的聚酮类化合物

聚酮(Polyketides)是一类由细菌、真菌、植物与动物所生产的次级代谢产物。解淀粉芽胞杆菌产生的聚酮类物质性质优良，具有重要开发价值。Chakraborty 等[34]研究了与食用红藻(Rhodophyta)相关解淀粉芽胞杆菌的抗菌聚酮类化合物，并研究了编码聚酮合成酶(pks)基因。以生物活性为导向、利用乙酸乙酯萃取方法，分离出对人类机会性食品致病微生物具有抗菌活性的聚酮化合物3-(8-氢-9-异丙基-2H-苯并[h]色烯-4-基)-2-甲基丙基苯甲酸酯和甲基8-(2-(苯甲氧基)-乙基)-6-氢-4-((E)-戊-2-烯基)-2H-色烯-6-羧酸酯。研究发现其疏水特性与抗菌活性紧密相关。Chakraborty等[35]从海藻裸子孢子中分离到一种异养海洋解淀粉芽胞杆菌，该菌对致病菌嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、哈维弧菌(Vibrioharveyi)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)和副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)具有广谱抗菌活性。该菌具有功能性I型聚酮合酶-1基因(pks-1)，用于合成4个具有聚酮骨架的同源化合物，包括11-(15-丁基-13-乙基-四氢-12-氧代-2H-吡喃-13-基)丙基-2-甲基苯甲酸酯、9-(四氢-12-异丙基-11-氧代呋喃-10-基)-乙基-4-乙氧基-2-羟基苯甲酸酯、12-(氨基甲基)-11-羟基己基-10-苯基丙酸酯和7-(14-羟基丙-13-基)-8-异丁基-7,8-二氢苯并[C]氧杂-1(3H)-酮。这4种化合物对副溶血性弧菌和创伤弧菌(抑制区直径≥15 mm，圆盘上为100 mcg)具有显著抗菌活性。可见，不同解淀粉芽胞杆菌产生的聚酮类物质的抗菌活性各异。进一步开发解淀粉芽胞杆菌产生的聚酮化合物，研究其抗菌活性和机制，必将为新药开发奠定科学基础。

解淀粉芽胞杆菌可广泛应用于农业生产、食品工业、环境保护、化妆品行业、医药以及沙漠治理等领域。这些应用与解淀粉芽胞杆菌的特性和相关功能紧密相连。正因为解淀粉芽胞杆菌有多方面生理功能，才使其应用的广泛性成为可能[36]。同样，解淀粉芽胞杆菌产生的生物多聚物具有功能多样性的特性，充分挖掘其多聚物资源，必然为解淀粉芽胞杆菌多聚物的应用奠定基础。

5 展 望

解淀粉芽胞杆菌在众多领域的广泛应用与该菌产生的生物多聚物的特性和相关功能紧密相连，其产生的重要多聚物与其代谢途径密不可分。提高其多聚物的产量，阐明其复杂的代谢网络，是今后的发展方向。解淀粉芽胞杆菌在自然界分布广泛，其自身在生长过程中产生多种多样的代谢产物，除了具有抗植物病原菌物质外，还具有产生上述多种生物聚合物的能力，提高解淀粉芽胞杆菌有价值的多聚物合成具有重要价值。充分挖掘解淀粉芽胞杆菌的菌种资源，分离纯化其特色生物多聚物，提高其产量是相关领域科学工作者的重要任务。随着生物技术的发展，微生物来源代谢产物代替传统的化学制剂势在必行。分子生物学技术为解淀粉芽胞杆菌基因功能、代谢途径、代谢网络研究提供了先进方法。相信在不久的将来，解淀粉芽胞杆菌生物多聚物的开发将更加充分，其应用也必将更加广泛。