海洋链霉菌酰基辅酶A硫酯酶基因的克隆及分析

薛永常， 胡泰文

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

放线菌特别是其中的链霉菌属可以产生包括非核糖体肽、脂肪酸、聚酮化合物等次生生理活性物质。目前已发现的抗生素70%来自链霉菌家族[1-2]。这些化合物在抗肿瘤、抗菌、酶抑制剂[3-5]等方面发挥着重要作用。酰基辅酶A硫酯酶(Acyl-CoA thioesterase，ACOT)是催化脂酰辅酶A水解为自由脂肪酸和辅酶A的一类酶，不仅能够代谢包含酰基辅酶A的各类化合物，还能代谢不饱和脂肪酰基辅酶A，在探索新的生物代谢途径及新药合成领域有重要意义[6-8]。ACOT大致分为I型或II型两类，其中Ⅱ型ACOT(ACOT II)对底物脂酰辅酶A具有较高的特异性，决定了ACOT II在脂肪酸合成途径具有重要的作用，介导了诸如能量产生、温度调节和信号分子合成等多种功能[9]。II型ACOT缺乏或失调会导致机体脂肪酸代谢紊乱，从而引起如炎症反应、II型糖尿病、脂肪肝、艾滋病[10-12]等一系列疾病。ACOT II基因缺失能导致聚酮 (PK)的产量显著降低[13]，基因敲除可使链霉菌杀假丝菌素的生物合成量下降90%[14]，可导致工程菌AF 1000中的(R)-3-羟基丁酸酯产率降低43%；而ACOTII基因的过表达能使(R)-3-羟基丁酸酯生产率和产量均增加1倍[15]。因此，对链霉菌ACOTII基因的研究不仅对探索脂肪酸代谢途径有重大意义，而且还可为指导疾病治疗和药物研发提供依据。本研究利用实验室保存的具有完整NRPS基因簇的海洋链霉菌，通过对其ACOTII基因进行克隆及生物信息学分析，为以后深入研究其结构与功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海洋链霉菌Streptiomycessp. L1[16]。大肠埃希菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21。

1.1.2 培养基 LB液体培养基、LB固体培养基、SOC培养基配置参考文献[17]。

1.1.3 试剂与仪器 柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)；FastPure质粒提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；T-Vector pMDTM19试剂盒、QuickCutTMBamH I(15 U/μL)、QuickCutTMEcoRI(15 U/μL)、QuickCutTMHind III(15 U/μL)(宝生物工程(大连)有限公司)；DNA Marker DL2000、TaqDNA polymerase(5 U/μL)(天根生化科技(北京)有限公司)Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；其他试剂均为国产分析纯；PCR Thermal Cycler Dice TP610(日本TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计 参考GenBank数据库中StreptomycesviridosporusATCC 14672(WP_004991247.1_1)、Streptomycesglaucescens(WP_043498495.1_1)、Streptomycesprasinopilosus(WP_055571148.1_1)及Streptomycesgriseochromogenes(WP_067311017.1_1)等Acyl-CoA thioesterase II基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物。同时在引物的5′端添加BamH I、EcoR I酶切位点，以利于后续操作：ACOT II MQs：5′-CGGGATCCCGAGGTCAACATCTTCCG-3′，ACOT II MQa：5′-GGAATTCACCACCGACACCAGCAGT-3′。

1.2.2 目的基因扩增及质粒转化 以Streptomycessp. L1基因组DNA为模板，以ACOT II MQs和ACOT II MQa为特异引物进行目的基因扩增。扩增体系20 μL：ddH2O 14.6 μL，10× PCR buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1 μL，ACOT II MQa(10 μmol/L)及ACOT II MQs(10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA polymerase(2.5 U/μL)0.4 μL，基因组DNA 1 μL。扩增条件：预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 35 s，退火58 ℃ 45 s。延伸72 ℃ 45 s。共35个循环。回收目的扩增产物与pMDTM19T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布于含有X-gal(20 μg/mL)、IPTG(24 μg/mL)和Amp (50 μg/mL)的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养12 h，挑取白色单菌落，提取重组质粒。

1.2.3 重组质粒的鉴定及分析 对提取的重组质粒进行特异引物PCR、双酶切及测序鉴定，并用MEGA 6.0和NCBI在线分析工具分析目的基因序列。

1.2.4ACOTII的原核表达 ①A表达载体构建：利用QuickCutTMEcoR I和QuickCutTMBamH I对pET32a (+)及构建的重组质粒pMD19T-ACOT II进行双酶切，回收相应目的片段。将回收的ACOTII目的片段与pET32a (+)大片段连接，转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞。②目的蛋白诱导表达及SDS-PAGE分析：分别培养只含pET32a(+)单克隆菌及含有重组子pET32a(+)-ACOT II单克隆菌落。取相应的含pET32a(+)菌液作为对照，在含pET32a(+)-ACOT II的菌落培养液中加入适当浓度的IPTG，以诱导表达目的蛋白。培养液4 ℃，12 000 r/min离心，菌体沉淀中加入50 μL的2×SDS上样缓冲液，振荡悬浮，沸水浴加热5 min，冰上冷却3 min，12 000 r/min离心1 min，取适量上清液进行SDS-PAGE分析。

2 结果与分析

2.1 ACOT II目的基因的扩增

以Streptiomycessp. L1基因组DNA为模板，以ACOT II MQs和ACOT II MQa为特异引物，扩增目的ACOTII基因，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

图1 ACOT II基因扩增产物凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ACOT II gene fragment M:Trans2K® Plus DNA Marker; 1、2: 扩增的ACOT II产物 M:Trans2K® Plus DNA Marker; 1，2: Amplified products of ACOT II

从图1可以看出，在800 bp左右出现了单一的清晰条带，扩增片段大小与预期的ACOTII基因基本一致，并以此为基础进行下一步的实验。

2.2 重组质粒的鉴定

将目的基因片段回收，与pMD19-T Vector连接，转化大肠埃希菌DH 5 感受态细胞，在含有X-Gal、Amp和IPTG的LB固体培养基上培养12 h，进行蓝白斑筛选。挑选白色阳性单克隆菌落，提取其质粒DNA，1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。

图2 质粒DNA电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmid DNA M: Trans2K® Plus DNA Marker; 1、2: 重组质粒 M: Trans2K® Plus DNA Marker; 1，2: recombinant plasmid DNA

从图2可知，在约3 500 bp出现了一条清晰的条带，为提取质粒所呈条带，和目的质粒大小一致，证明可能是需要的重组质粒。

以质粒DNA为模板，利用特异引物ACOT II MQs和ACOT II MQa进行PCR扩增，结果见图3。

图3 质粒DNA中扩增ACOT II基因电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of ACOT II gene from recombinant plasmid DNA M: DNA Marker DL2000; 1: 质粒DNA扩增ACOT II基因 M: DNA Marker DL2000; 1: ACOT II fragment amplified from recombinant plasmid

从图3中可以看出，在约800 bp有一条清晰的条带，且无杂带，说明该重组质粒含有插入的目的基因片段，且与预期大小相符。选择pMD19-T载体含有的EcoR I、Hind III酶切位点，对提取的质粒进行双酶切验证，结果见图4。

图4 重组质粒双酶切电泳图Fig.4 Recombinant plasmid cut by Hind III and EcoR I M: Trans2K® Plus DNA Marker; 1、2: 重组质粒Hind III/EcoR I 双酶切 M: Trans2K® Plus DNA Marker；1，2: recombinant plasmid cut by Hind III and EcoR I

从图4中可以看出，在约2 800 bp和800 bp左右各出现1条清晰的条带，大小与pMD19-T 载体及目的片段大小基本相符。将重组质粒送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

2.3 目的片段测序及序列分析

测序结果表明目的片段为786个碱基，大小与预期值基本相符。该重组质粒命名为pMD19T-ACOT II。利用ORF Finder查找ACOTII的开放阅读框，结果见图5。将ACOTII基因的拟翻译氨基酸序列提交NCBI，在线BLAST进行分析，结果见图6、图7。选取8株与目的基因具有较高同源性的序列，通过MEGA 6.0邻接法构建系统发育树，结果见图8。

同源性分析表明，克隆的基因片段与Acyl-CoA thioesterase II(Unclassified Streptomyces)(sequence ID: WP 069742521.1)相似度达到100%。BLAST比对发现，该基因序列中含有一个Hot-Dog superfamily核心结合区，属于热狗超家族成员。该超家族成员包含II型硫酯酶结构域(图7)。II型硫酯酶结构域可以通过水解作用去除肽基载体蛋白(PCP)和酰基载体蛋白(ACP)域上的乙酰基来启动模块化PKS的合成。ACOT II具有一种不对称的热狗折叠结构，其结构与PaaI硫酯酶、4-羟基苯甲酰-CoA硫酯酶(4HBT)和β-羟基癸酰-ACP脱水酶中发现的结构相似。因此可以断定克隆目的基因片段属于ACOTII。

而系统进化树结果显示，不同链霉菌中 II型酰基辅酶A硫酯酶基因具有较近的进化关系，其中ACOTII与StreptomycesviridosporusATCC 14672属于同一分支，同源性达到99%以上，亲缘关系最近。

图5 ACOT II基因的ORF Finder结果Fig.5 The results of ORF Finder of ACOT II gene

图6 ACOT氨基酸序列比对Fig.6 Alignment of ACOT amino acid sequence

图7 ACOT II基因的BLAST比对分析图Fig.7 The analysis of comparison results in BLAST of ACOT II gene

图8 ACOT II系统发育树构建 Fig.8 The phylogenetic tree of ACOT II

2.4 ACOT Ⅱ的原核表达与SDS-PAGE分析

将含有pET32a(+)及pET32a(+)-ACOT II的单克隆菌分别进行培养至OD600为0.6。加入IPTG使终浓度为0.5 mmol/L，诱导目的蛋白的表达。每隔1 h取样，样品处理后进行SDS-PAGE，结果见图9。

图9 ACOT II拟表达蛋白SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of ACOT II expression M:蛋白Marker；1：无IPTG诱导下的pET32a(+)表达；2：IPTG诱导下的pET32a(+)表达；3：无IPTG诱导下的pET32a(+)-ACOT II表达；4：IPTG诱导1 h的pET32a(+)-ACOT II表达；5：IPTG诱导2 h的pET32a(+)-ACOT II表达；6：IPTG诱导3 h的pET32a(+)-ACOT II表达 M: protein Marker；1: pET32a (+) expression without IPTG induction；2: pET32a (+) expression induced by IPTG； 3: pET32a(+)-ACOT II expression without IPTG induction; 4: pET32a(+)-ACOT II expression induced by IPTG for 1 h；5： pET32a(+)-ACOT II expression induced by IPTG for 2 h；6: pET32a(+)-ACOT II expression induced by IPTG for 3 h

由图9可知，作为对照的pET32a(+)质粒在添加诱导物IPTG前、后，对其本底表达没有影响。而含有pET32a(+)-ACOT II的菌株，在未加入IPTG时，没有目的蛋白的表达；在加入IPTG诱导表达1 h后，在37 kD左右出现明显的条带，并且随诱导时间的延长，其表达量会逐渐增加，在诱导3 h时达到最大，说明ACOTII基因在大肠埃希菌BL21(DE3)得以表达。

3 讨 论

II型ACOT作为可以广泛水解硫酯键的一类酶，可以裂解支链脂肪酸、短链和长链饱和及不饱和酰基CoA等多种含CoA的底物，在脂肪酸合成途径中形成游离的脂酰CoA，在II型ACOT的水解作用下卸载了多余的CoA分子，形成完整的脂肪酸。在PKS途径中II型ACOT行使水解产物和纠错功能，即催化反应完全的硫酯CoA从PKS上脱落和清除不能被PKS延伸利用的异常硫酯CoA在内的中间产物，从而影响了相应次级代谢产物的产量，这对次生代谢产物产量的提高提供了基础。

本研究从海洋链霉菌Streptiomycessp. L1基因组扩增获得ACOTII基因，其与Acyl-CoA thioesterase II (sequence ID：WP 069742521.1)相似性达到100%。BLAST比对发现，其属于热狗超家族成员，并包含一个II型硫酯酶结构域，该结构域为ACOT II催化反应的特有区域。在0.5 mmol/L的IPTG诱导下，目的基因能表达得到1分子量为37.0 kD左右的蛋白。本研究诱导表达的蛋白与在线分析预测的理论值略有差别，可能是表达蛋白发生了一定程度的磷酸化或者糖基化修饰，或者“HotDog”结构域基因与表达载体基因组之间发生了融合，共表达形成了Rosetta蛋白，从而产生了以热狗结构域为基础功能和结构的多样性[18]。这为进一步研究II型硫酯酶的分子结构和生物学功能，为新兴药物和新型抗生素的研发提供参考。