5-甲基间苯二酚对铜绿假单胞菌及其生物膜形成的影响

2021-08-10 07:12付菊花佘鹏飞
微生物学杂志 2021年3期
关键词:浮游肉汤静置

朱 娟, 付菊花, 佘鹏飞, 伍 勇*

(1.中南大学 湘雅三医院检验科,湖南 长沙 410013;2.中南大学 湘雅三医院人力资源部,湖南 长沙 410013)

细菌生物膜(biofilm, BF)是细菌及其分泌的胞外基质等物质所形成的膜状聚合物,其胞外基质主要由细菌分泌的细胞外多糖、胞外DNA、脂类和蛋白质等组成[1]。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaureginosa)是一种院内感染常见的条件性致病革兰阴性杆菌,易在医疗器械和人体组织表面形成BF[2]。P.aureginosaBF的形成主要分三步:①初始黏附期:细菌通过鞭毛的介导作用,游向介质表面,并通过菌毛等表面黏附因子黏附在宿主表面,此阶段的BF易受到外界物质的破坏;②BF形成期和成熟期:此阶段的细菌分泌大量胞外多糖, 从而加固BF厚度及硬度, 对外部侵入具有更强的保护作用,此阶段的BF所包裹的菌团内部可形成一个亲水性的孔道, 可给BF输送各种营养物质及排出各种代谢产物;③BF分散期:BF成熟一定时间后, 部分细菌会从BF中游离出来,参与到下一个BF形成的循环过程中[3-4]。据统计,感染相关性疾病中BF的形成率超过75%。BF的存在大大提高了微生物的耐药性,其耐药性是浮游细菌的10~1 000倍[5]。BF的形成具有屏障作用,能限制抗菌药物分子渗透进入膜内与膜内细菌作用, 从而导致抗菌药物只能杀灭表层细菌,而无法对深部细菌发挥作用。此外,带负电荷的胞外脂多糖可与抗菌药物分子结合, 并显著降低进入BF内的药物浓度,也使得抗菌药物对BF内细菌的作用显著降低。一旦形成BF,就很难用常规的抗生素根除[6]。因此,开发新的抗菌剂对抗BF的形成是当务之急。5-甲基间苯二酚是常见的革兰阴性杆菌代谢产物[7],然而外源性的5-甲基间苯二酚对细菌的影响还尚未研究。因此,本研究通过建立体外P.aureginosaBF模型,探讨5-甲基间苯二酚的抗菌活性并进一步研究其对P.aureginosaBF的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 铜绿假单胞菌(P.aureginosa)标准菌株PAO1由南开大学乔明强惠赠。铜绿假单胞菌临床菌株于2014年1月至12月分离自中南大学湘雅三医院检验科痰液标本。

1.1.2 培养基 LB肉汤(上海索莱宝公司);MH肉汤(美国Oxoid公司)。

1.1.3 主要试剂与仪器 96孔板(美国Corning/Costar公司);5-甲基间苯二酚(上海源叶生物有限公司);恒温培养箱(YXQ602,美国ThermoFish公司);酶标仪(美国Bio-Rad公司);麦氏比浊仪(法国梅里埃公司);恒温摇床(ZWY-100H,美国ThermoFish公司)。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 挑取培养过夜的单个菌落于MH肉汤中,用麦氏比浊仪控制菌液浊度0.5 McF,稀释100倍后,于96孔板中每孔加入50 μL,再将5-甲基间苯二酚用MH肉汤倍比稀释后分别加入每孔,于恒温培养箱中37 ℃静置孵育16~18 h后判读结果。最低抑菌浓度即为开始出现肉眼不可见浊度的最低药物浓度[8]。

1.2.2 时间-生长曲线 用LB肉汤将5-甲基间苯二酚稀释至工作质量浓度(0~1 500 μg/mL)备用。挑取培养过夜的单个菌落于LB肉汤中37 ℃,180 r/min摇床培养过夜,用已稀释的5-甲基间苯二酚将细菌稀释至约106cfu/mL,37 ℃,180 r/min摇床培养24 h,分别于4、8、16 h时吸取200 μL至96孔板,酶标仪检测630 nm处的吸光度,即为细菌浊度[9]。

1.2.3 5-甲基间苯二酚对P.aureginosaBF形成的影响 挑取培养过夜的单个菌落于LB肉汤中,37 ℃,180 r/min摇床培养24 h后,用LB肉汤稀释细菌至约2×106cfu/mL,再分别加50 μL至96孔板中。将5-甲基间苯二酚用LB肉汤倍比稀释后,分别加50 μL至已加菌液的孔中,37 ℃静置培养24 h后,用1×PBS洗去未与孔壁结合的浮游细菌,每孔再分别加入100 μL 0.25%的结晶紫染液,静置染色15 min后,弃去结晶紫染液,并用1×PBS洗去未结合的结晶紫,于室温晾干后,每孔分别加入100 μL 95%乙醇溶液溶解结晶紫,静置孵育20 min后,用酶标仪检测570 nm处吸光度,即为生物膜的相对量[10]。

1.2.4 5-甲基间苯二酚分散P.aureginosa已形成的BF 挑取培养过夜的单个菌落于LB肉汤中培养24 h后,用LB肉汤稀释至约2×106cfu/mL,分别加200 μL至96孔板中,37 ℃静置培养24 h后,用1×PBS洗去未与孔壁结合的浮游细菌,每孔再分别加入200 μL倍比稀释的5-甲基间苯二酚。静置孵育24 h后,用1×PBS洗去未与孔壁结合的浮游细菌,结晶紫染色,方法同1.2.3[10]。

1.2.5 统计学分析 通过Excel和GraphPad7.0完成统计学分析。平均值±标准差表示计量资料,采用t检验进行两个独立样本之间的比较,P<0.05为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 5-甲基间苯二酚对P.aureginosa浮游细菌的影响

与对照组相比较,当5-甲基间苯二酚的质量浓度≤100 μg/mL时,对P.aureginosa浮游细菌的增殖无影响。而当其质量浓度≥250 μg/mL时,可显著抑制P.aureginosa浮游细菌的增殖,随着5-甲基间苯二酚的浓度增高,其抑制能力增强。浮游细菌的增殖对5-甲基间苯二酚浓度具有显著的剂量依赖性,见图1。

图1 5-甲基间苯二酚对P.aureginosa PAO1浮游细菌增殖的影响Fig.1 Effects of 5-methylresorcinol on planktonic cell growth of P. aureginosa PAO1

2.2 5-甲基间苯二酚对P.aureginosa BF 形成的影响

当5-甲基间苯二酚的质量浓度为512 μg/mL时,可显著抑制PAO1生物膜的形成,使其生物膜的形成量从(1.082±0.059)减少到(0.782±0.062)(t=6.071 0,P=0.003 7),当5-甲基间苯二酚的质量浓度增加到1 024 μg/mL时,生物膜的形成量减少到(0.093±0.037)(t=24.600,P<0.000 1)。然而,不同菌株对5-甲基间苯二酚的敏感性不同,5-甲基间苯二酚对铜绿假单胞菌临床菌株PA47生物膜的形成无影响,见图2A;同时,32 μg/mL的5-甲基间苯二酚还能显著分散PAO1成熟生物膜,使其生物膜从(2.010±0.130)减少到(1.352±0.071)(t=7.694 0,P=0.001 5)。且由图1可知,5-甲基间苯二酚的质量浓度≤100 μg/mL时,对P.aureginosa浮游细菌的增殖无影响。因此,5-甲基间苯二酚对PAO1的生物膜的抑制作用不仅归因于其杀菌作用,还存在其他机制。而当5-甲基间苯二酚的质量浓度≥128 μg/mL时,可显著分散PA47生物膜,使其BF从(3.025±0.098)减少到(2.423±0.273)(t=3.595 0,P=0.022 9)。但随着5-甲基间苯二酚的浓度增加,无显著的剂量依赖性,见图2B。

图2 5-甲基间苯二酚对P.aureginosa BF的影响Fig.2 Effects of 5-methylresorcinol on the biofilms of P.aureginosa A:5-甲基间苯二酚对P.aureginosa BF的抑制作用,*表示与对照组相比,5-甲基间苯二酚对PAO1生物膜的抑制有统计学差异;B:5-甲基间苯二酚对P.aureginosa BF的分散作用,#表示与对照组相比,5-甲基间苯二酚对PAO1生物膜的分散有统计学差异,*表示与对照组相比,5-甲基间苯二酚对PA47生物膜的分散有统计学差异 A: Biofilm inhibitory effects of 5-methylresorcinol against P.aureginosa,* indicates that 5-methylresorcinol has a statistically significant difference in inhibition of PAO1 biofilm compared with the control group;B: Biofilm eradication effects of 5-methylresorcinol against P.aureginosa,# indicates that 5-methylresorcinol has a statistically significant difference in the eradication of PAO1 biofilm compared with the control group, * indicates that 5-methylresorcinol has a statistically significant difference in the eradication of PA47 biofilm compared with the control group

2.3 5-甲基间苯二酚对P.aureginosa临床菌株BF形成的影响

不同P.aureginosa临床菌株对5-甲基间苯二酚的敏感性各异。512 μg/mL的5-甲基间苯二酚可显著抑制PA1434和PA1430生物膜的形成;1 024 μg/mL的5-甲基间苯二酚可显著抑制PA1401、PA1409、PA1434、PA1435、PA1439、PA1447和PA1430生物膜的形成。而5-甲基间苯二酚对PA1429和PA1440生物膜形成无影响,见图3。

图3 5-甲基间苯二酚对P.aureginosa 临床菌株BF的抑制作用Fig.3 Biofilm inhibitory effects of 5-methylresorcinol against clinical isolates of P.aureginosa

3 讨 论

生物膜相关疾病已成为临床诊疗中的棘手难题。传统抗生素常难以根除人体内已形成的生物膜。新药的开发利用已成为当今研究的热点,而5-甲基间苯二酚对P.aureginosa的影响尚未见研究。本研究发现,5-甲基间苯二酚能有效抑制P.aureginosa的增殖,且亚抑菌浓度的5-甲基间苯二酚能抑制其生物膜的形成。

本研究发现铜绿假单胞菌不同临床菌株的生物膜对5-甲基间苯二酚的敏感性不同。一方面,不同细菌的细胞壁组分不同,当细胞壁较厚或者外排泵表达增高时,可能导致5-甲基间苯二酚无法充分进入细菌细胞内发挥作用[11];另一方面,不同菌株群体密度感应(quorum sensing, QS)系统各组分的表达存在异质性(P.aureginosa生物膜的形成周期主要受QS系统调控)[12-13],QS系统相关受体表达量的改变可影响5-甲基间苯二酚的作用效果。

单独使用抗菌药物往往难以彻底根除生物膜,随着剂量的增加,药物的毒副作用也随之增强[14]。因此,5-甲基间苯二酚与其他P.aureginosa相对敏感抗生素联合应用,以期增加药物协同作用,降低药物的毒性,这将成为研究的重点。

P.aureginosa生物膜状态下的耐药性极大增加,常规用药难以有效清除体内的生物膜。亚抑菌浓度的5-甲基间苯二酚能有效抑制P.aureginosa生物膜的形成,有望成为治疗P.aureginosa相关生物膜病的有效手段。

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