内源性Relaxin-1 Relaxin-3及其受体LGR7表达水平在小鼠心房颤动心肌纤维化中的作用

翁方中，胡朝梁，严 骏，戴 伟，周瑞祥

(湖北省武汉市第一医院重症医学科，湖北 武汉 430022)

房颤是最常见的心律失常，一般人群房颤患病率可达0.4%～1.0%，且随着年龄增长房颤患病率明显增加，据报道年龄≥85岁以上人群房颤患病率可达17.4%。心肌纤维化则是心律失常的主要病理表现之一，且难以逆转[1]。当前临床依据心肌纤维化的病理特征将其划分为反应性纤维化、或是修复性纤维化两种，两种心肌纤维化虽具不同的病理表现，但均可诱导心肌损伤，引起心脏重构、心功能不全或心肌坏死。研究证实内源性肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteron system,RAAS)、内皮素(endothelin，ET)-一氧化氮(nitric oxide,NO)系统等心脏旁分泌系统或自分泌系统在心肌纤维化的发生发展中扮演重要角色[2]；但关于内源性抗心肌纤维化防御体系研究甚少，其作用尚不清楚，如松弛素(Relaxin,RLX)，作为迄今最强的内源性抗纤维化物质之一[3]，其抗心肌纤维化的机制也仍未阐明。鉴于此，本研究拟通过观察内源性Relaxin-1、Relaxin-3及松弛素受体(RLXreceptor,LGR7)的表达变化及Relaxin对心肌纤维化的影响，为探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物：C57B62小鼠[湖南斯莱克景达实验动物有限公司《许可证号：SCXK(湘)2013-0004》]40只，雄性，14周龄，体重25±3g；所有小鼠均饲养于清洁级环境中，按12h间隔光照黑暗交替，温度20～25℃，湿度40%～70%，自由饮食饮水，普通饲料。实验严格遵循实验动物使用3R原则。

1.2房颤模型建立：40只C57B62小鼠适应性喂养一周后随机分为空白对照组、模型组、模型组+RLX1、模型组+RLX3组，每组10只。模型组、模型组+RLX1、模型组+RLX3组均构建心房颤动小鼠模型：腹腔注射ISO 2.5mg·kg-1·d-1，空白对照组腹腔注射等量生理盐水；连续注射2周后应用MedLab-U/4C501H生物信号采集处理系统描记小鼠心电图，对照组为标准Ⅱ导联心电图，建模大鼠则为标准Ⅱ导联心房颤动，提示房颤模型建立成功；模型组+RLX1、模型组+RLX3组分别在造模成功后次日腹腔注射终浓度为100 ng/mL的RLX1、RLX3，连续注射7 d，空白对照组、模型组注射等量生理盐水；一周后处死小鼠，取心脏组织备用。见图1。

图1 对照组小鼠与建模小鼠的Ⅱ导联心电图

1.3组织标本处理：20mg/kg 1%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉；小鼠前胸开口，剪开左心耳，心间部穿刺后应用20mL肝素盐水灌注，待血液灌注干净后取材；取4只小鼠仅保留左心室(每只小鼠左心室分3份)，液氮保存用于检测Real-Time PCR检测、Western Blot法；其余小鼠心脏组织制成4 μm厚的石蜡包埋切片(平行心脏纵轴连续切片)保存待检。

1.4心肌胶原沉积纤维面积及心肌羟脯氨酸含量检测：应用天狼星红染色观察心肌纤维化，取石蜡切片常规脱蜡，苦味酸15s使背景变成红色，1∶9比例的天狼猩红:苦味酸滴染3min，无水乙醇10s、二甲苯3min，而后封片、镜检；采用Leica显微镜采集图像，NIS-Elements 3.0分析图像，Image-Pro plus 6.0软件分别计算左心室、右心室、室间隔胶原沉积纤维面积百分比(胶原沉积纤维面积/整个心肌面积)。取20 mg液氮中心肌组织，应用羟脯氨酸试剂盒检测心肌羟脯氨酸含量，取30～100 mg左心室心肌组织，参照试剂盒说明书提取上清液，测定波长550时的吸光度(A)值，计算羟脯氨酸含量(μg/mg湿重)=(测定A值-空白A值)/(标准A值-空白A值)×标准品浓度(5μg/mL)×水解液总体积(10mL)/组织湿重(mg)。

1.5心肌Relaxin 1、Relaxin3其受体LGR7表达：①Real-Time PCR法：依据TRIzol试剂盒说明书步骤提取小鼠左心室组织总RNA，分光光度剂测定RNA浓度及纯度，参照TaKaTa逆转录试剂盒说明书逆转录获得cDNA，应用Real-Time PCR检测心肌Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA，以GAPDH为内参；应用灰度扫描系统分析电泳条带，半定量分析心肌Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA水平(引物序列见表1)。②Western Blot法：提取心肌组织蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，按20μg/孔上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转PVDF膜，脱脂牛奶室温封膜后加入Relaxin 1抗体、β-actin抗体，40℃过夜。0.5% TBST洗膜、加二抗孵育60 min，洗膜后应用化学发光法曝光拍照，Gel-pro 32图像分析软件定量分析结果，目的蛋白表达量与内参照β-actin的灰度比值为目的蛋白相对表达量。参照上述Real-Time PCR法、Western Blot法检测Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7蛋白表达。

表1 引物序列表

1.6α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)的表达和组织分布：①免疫组化法：取组织石蜡切片常规脱蜡水化，过氧化氢灭活过氧化物酶，热修复抗原后滴加α-SMA一抗，4℃过夜，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min，而后滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作也，双花扁豆凝集素(DBA)显色、封片；Image-Pro 5.1图像分析软见分析α-SMA表达，每张切片取5个连续阳性表达(镜下可见棕褐色颗粒)视野，测定积分光密度(integral optical density,IOD)。②Western Blot法：参照1.5中Western Blot法步骤检测心肌组织α-SMA蛋白表达，同样以目的蛋白表达量与内参照β-actin的灰度比值为目的蛋白相对表达量，Western Blot法参照方法1.5。

1.7心肌纤维相关指标表达：测定I型胶原蛋白(collagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)mRNA及蛋白表达；Real-Time PCR、Western Blot检测方法参照1.5。

1.8心肌血管紧张素Ⅱ(AngiotensionⅡ,AngⅡ)、醛固酮(Aldosterone,ALD)及其受体表达：Real-Time PCR法检测心肌AngⅡ、血管紧张素受体1(angiotensin receptor 1,AT1)、血管紧张素受体2(angiotensin receptor 2,AT2R)、醛固酮(Aldosterone,ALD)、盐皮质激素受体MineralocorticoidReceptor，MR)mRNA表达，Real-Time PCR检测方法参照1.5。

2 结 果

2.1各组心肌胶原沉积纤维面积百分比、心肌羟脯氨酸含量比较：天狼猩红染色可见心肌胶原纤维呈红色，心肌细胞呈黄色表达，主要沉积于心肌细胞间隙、心肌血管周围，空白对照组仅可见少量心肌胶原纤维沉积(图A)，模型组可见大量心肌胶原纤维沉积(图B)，模型组+RLX1、模型组+RLX3心肌胶原纤维沉积较模型组明显减少(图C、D)(见图2)；模型组心肌胶原沉积纤维面积百分比，心肌羟脯氨酸含量较空白对照组显著上升(P<0.05)；模型组、模型组+RLX1、模型组+RLX3组室间隔、右心室及左心室心肌胶原沉积纤维面积百分比，心肌羟脯氨酸含量差异有统计学意义(P<0.001)；与模型组比较，模型组+RLX1、模型组+RLX3室间隔、右心室及左心室心肌胶原沉积纤维面积百分比，心肌羟脯氨酸含量明显下降(P<0.016)，但模型组+RLX1、模型组+RLX3比较差异无统计学意义(P>0.016)，见图2、表2。

图2 天狼猩红染色图

表2 各组心肌胶原沉积纤维面积百分比心肌羟脯氨酸含量比较

2.2各组Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7比较：与空白对照组比较，模型组Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白表达明显下降(P<0.05)；模型组、模型组+RLX1、模型组+RLX3组Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白差异有统计学意义(P<0.001)，与模型组比较，模型组+RLX1、模型组+RLX3 Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白则明显上升(P<0.016)，但模型组+RLX1、模型组+RLX3比较差异无统计学意义(P>0.016)，见表3。

表3 各组Relaxin 1 Relaxin 3 LGR7比较

2.3各组α-SMA IOD、α-SMA蛋白比较：与空白对照组比较，模型组免疫组化图阳性染色明显增加(图A、B)，与模型组比较，模型组+RLX1、模型组+RLX3阳性染色明显减少(图C、D)；与空白对照组比较，模型组α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白表达明显上升(P<0.05)；模型组、模型组+RLX1、模型组+RLX3组 α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白比较差异有统计学意义(P<0.001)与模型组比较，模型组+RLX1、模型组+RLX3 α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白表达明显下降(P<0.016)，但模型组+RLX1、模型组+RLX3比较差异无统计学意义(P>0.016)，见图3、表4。

图3 α-SMA免疫组化图

表4 各组α-SMA collagenⅠ collagenⅢ比较

2.4各组心肌MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1 mRNA比较：与空白对照组比较，模型组MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白表达明显上升，TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白表达明显下降(P<0.05)；模型组、模型组+RLX1、模型组+RLX3组 MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白、TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白差异有统计学意义(F<0.001)，与模型组比较，模型组+RLX1、模型组+RLX3 MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白表达明显下降、TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白明显上升(P<0.016)，但模型组+RLX1、模型组+RLX3比较差异无统计学意义(P>0.016)，见表5。

表5 各组心肌MMP-1 MMP-2 MMP-9 MMP-13 TIMP-1比较

2.5各组大鼠Ang Ⅱ、ALD及其受体mRNA表达：与空白对照组比较，模型组Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA水平明显上升；模型组、模型组+RLX1、模型组+RLX3组 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA差异有统计学意义(P<.001)，与模型组比较，模型组+RLX1、模型组+RLX3 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA明显下降(P<0.016)，但模型组+RLX1、模型组+RLX3比较差异无统计学意义(P>0.016)，见表6。

表6 各组大鼠Ang Ⅱ ALD及其受体mRNA表达

3 讨 论

心房颤动的发病机制繁杂，心房重构则是心房颤动的重要病理环节之一，其最显著特征为心肌纤维化，正常心肌细胞被胶原纤维包绕划分，心肌细胞间的传导连续性被破坏，增加传导异质性并减慢传导速度，从而为折返环的形成及单项传导阻滞提供病生理基础[4,5]。当前临床抗心律失常药物的主要作用机制仍是针对心房电重构，治疗效果有限。心肌纤维化作为心房颤动的重要危险因素，探讨心房颤动患者心肌纤维化分子机制有重要意义，可为心房颤动的防治提供思路。Relaxin属多功能活性多肽，是体内分布极为广泛，参与神经垂体激素的分泌等广泛生理过程的调节，与肿瘤发展和转移，心血管疾病发病均有密切关联，并具强大的抗纤维化效应[6,7]。

本研究天狼猩红染色可见心房颤动小鼠心肌胶原纤维主要沉积于心肌细胞间隙、心肌血管周围，存在明显的心肌胶原纤维沉积，且心肌羟脯氨酸湿重明显增加。由此可见，心房颤动小鼠存在心肌纤维化，造模成功，且心房颤动心肌纤维小鼠心肌内源性Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7表达明显下调，存在表达缺失现象。为探究心房颤动心肌纤维小鼠心肌内源性Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7表达对心肌纤维化的影响机制，本研究分别对模型小鼠补充外源性RLX1、RLX3，结果显示外源性补充RLX1、RLX3后，模型组+RLX1、模型组+RLX3 小鼠心肌胶原纤维沉积、心肌羟脯氨酸湿重增加现象明显缓解；且在补充外源性RLX1、RLX3后，模型组+RLX1、模型组+RLX3 小鼠Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7蛋白明显上升。Kanai等[8]报道，Relaxin 1水平升高伴有心肌纤维化率降低，指出Relaxin 1可作为心室纤维化的生物标志物，可能成为抗纤维化治疗靶点。这与本研究结论相似，由此可见，Relaxin 1与心房颤动小鼠心肌纤维化有关。

另肌成纤维细胞的转分化也与心肌纤维化密切相关，研究指出，当心脏受炎性介质、压力超负荷等刺激时候多种细胞便可转分化为肌成纤维细胞，以α-SMA生成表达为特征性结构表现及标记[9]。而α-SMA又可通过抑制心肌细胞外基质降解酶来促进collagenⅠ、collagenⅢ分泌[10]。collagenⅠ、collagenⅢ作为心肌间质胶原蛋白的主要成分，其含量及比值发生变化便可导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积，最终引起间质网络重建及心肌纤维化[11]。本研究显示，与空白对照组比较，模型组小鼠α-SMA水平明显上升，collagenⅠ、collagenⅢ分泌也明显增强；但在补充外源性RLX1、RLX3后模型组+RLX1、模型组+RLX3 α-SMA表达较模型组明显下降，collagenⅠ、collagenⅢ分泌也明显减少。因此外源性补充RLX1、RLX3可下调心肌间质胶原蛋白含量，或能达到抑制间质网络重建、改善心肌纤维化的目的。MMPs、TIMPs则是细胞外基质的重要成分，其直接参与心肌胶原合成与降解，是维持细胞外基质稳态的关键。本研究显示，模型组MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13 mRNA及蛋白表达明显上升、TIMP-1 mRNA及蛋白表达明显下降；但补充外源性RLX1、RLX3后模型组+RLX1、模型组+RLX3 MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13 mRNA及蛋白表达较模型组明显下降、TIMP-1 mRNA及蛋白较模型组明显上升。这也进一步证实了外源性补充RLX1、RLX3在改善心肌纤维化上的价值。

研究指出[12]，心肌纤维化的发生与其自身的旁/自分泌活性物质AngⅡ mRNA、ALD mRNA表达及活性增强关系密切。Relaxin则是心血管活性物质，由心肌合成分泌，LGR7受体则主要富含于心室、心房，研究指出中枢系统Relaxin可通过抑制AngⅡ表达来调节中枢渗透压[13]。本研究显示模型组Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA水平明显上升，提示心肌纤维化小鼠心肌Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA存在明显过表达现象，这与往期报道结论相似[14]。但补充外源性RLX1、RLX3后，模型组+RLX1、模型组+RLX3 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA较模型组明显下降。由此可见，Relaxin可能通过作用于心脏旁/自分泌的AngⅡ及ALD系统拮抗心肌纤维化，或可作为机体抗纤维化的内源性防御体系。

综上所述，由此可见，心房颤动心肌纤维化小鼠内源性Relaxin-1、Relaxin-3表达过低现象，补充外源性RLX1、RLX3可明显改善其内源性Relaxin-1、Relaxin-3表达过低现象，并有效改善心肌纤维化，分析Relaxin可能通过作用于AngⅡ及ALD系统拮抗心肌纤维化，值得临床重视。