丹白颗粒对宫腔粘连大鼠TGF-β/Smad信号通路及内膜纤维化的影响

谭丽萍, 吴美丽, 任婧婧, 巩 恒, 潘红霞, 杨弋弋

(1.中药制药共性技术国家重点实验室, 山东 临沂 276006 2.山东省青岛市妇女儿童医院妇科，山东 青岛 266011 3.河南省南阳市中心医院医院妇科，河南 南阳 473000)

宫腔粘连(Intrauterine adhesions，IUA)是由于子宫内膜损伤导致宫腔内形成不规则的粘连，可引起经血或宫腔分泌物流通不畅，甚至完全受阻，产生经血潴留、宫腔积液，从而引发痛经、闭经、继发性感染、不育等[1,2]。IUA由子宫损伤、子宫感染等多种因素引起，其中流产清宫引发IUA最为常见，随着人工流产率的增高，近年来IUA的发病率呈现上升趋势，严重影响现代女性的生育要求及生活质量[3，4]。很多学者认为子宫内膜损伤过程中内膜纤维化程度加深、纤维瘢痕组织的形成增多是IUA形成的可能机制[5]。转化生长因子1(Transfer growth factor 1，TGF-β1)是TGF家族成员，与创面修复愈合密切相关，体内高表达的TGF-β1对于纤维瘢痕组织的形成有促进作用，是较强的促纤维化因子，Smad是TGF-β家族的信号传导分子，TGF-β1活化后与Smad3相互识别，TGF-β1/Smad3信号通路在纤维瘢痕组织的形成中发挥重要作用[6]。目前关于IUA的治疗主要是在宫腔镜下行宫腔粘连分离术，但其复发率较高，因此探究可缓解IUA病情的药物进行早期治疗仍是研究的热点[7]。丹白颗粒中牡丹皮、大血藤、莪术、当归等药物具有调经止痛、活血化瘀、清热解毒等功效，具有较强的活血、抗炎、抑菌等作用，适用于慢性盆腔炎等妇科疾病，但关于宫颈粘连的疗效并不清晰。在查阅资料确定丹白颗粒具有清热化瘀、祛湿止痛等功效后，本研究通过建立大鼠IUA模型，观察丹白颗粒对IUA模型的影响，为丹白颗粒对于IUA的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1动物:SPF级健康SD雌性大鼠(广东省医学实验动物中心)，约4月龄，体重为200～260g，生产许可证号：SCXK(粤)2016-0002，动物质量合格证号：省科委2000A027。所有大鼠于本院动物房中饲养，自然光照，温度25℃，相对湿度55%，自由进食、进水，保持动物房环境整洁、每周清洁一次鼠笼、每天更新食物及饮用水。本研究经动物伦理委员会批准同意。

1.2主要试剂及仪器:丹白颗粒(牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪术、败酱草、川芎、白芍、土茯苓、白英、白花蛇舌草、墓头回、椿皮、当归，批号：Z20090651，规格8g/袋)购于山东新时代药业；苏木素染液(批号：YYJK-923)、伊红染液(批号：230251)、Masson染色试剂盒(批号：G1340)、羟脯氨酸试剂盒(批号：ml064306)购于美国Sigma公司；尼康SMZ745光学显微镜(批号：325435)购于上海普赫生物科技有限公司；TGF-β1、Smad3、Smad7、兔抗鼠单抗(货号：ab08638、ab07994、ab07999)、羊抗兔IgG二抗(货号：ab150077)、GAPDH(货号：ab73299)购于美国Abcam公司；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒(货号P0027、P0011，)购于上海碧云天公司；GIS-500凝胶成像仪(批号：1306412)购于Miulab公司；酶标仪(型号XElx800)购于美国Perkin Elmer公司。

1.3方 法

1.3.1动物模型制备、分组给药及实验分配:参考文献[8]每日10∶00通过阴道脱落细胞法确定大鼠动情周期，持续观察7d，选取动情期间的大鼠进行手术，术前禁食不禁水12h。将大鼠随机分为假手术组(15只)和模型组(65只)，参考文献[9]制备IUA模型，将医用无菌手术线浸泡于脂多糖生理盐水溶液(6mg/L)中24h备用，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg)将大鼠麻醉后切开大鼠下腹正中部位，找到大鼠“V”型子宫后于宫颈上方约5mm处作长度约为4mm的切口，采用刮勺经切口进行刮宫手术，待宫腔表面有粗糙感时停止刮宫，将提前准备好的脂多糖棉线放入大鼠宫腔内加重感染，用生理盐水冲洗宫腔后进行缝合，24h后取出棉线，整个手术在无菌环境下进行，假手术组只做开腹及子宫缝合手术。9d后建模结束，观察到大鼠子宫呈现僵硬、扭曲，剖开子宫腔后显示管腔结构消失即为模型构建成功，本次实验造模成功60只，造模成功率为92.31%。预处理给药剂量参照人体表面积法计算，成年人标准体重60kg，对应给药剂量为成人的6.25倍，成人每日给药剂量为24g，则大鼠每日给药剂量为2.5g/kg，因此设置低、中、高剂量药物剂量为2.5、5.0、10.0g/kg。将建模成功的大鼠分为模型组、丹白低剂量组(2.5g·kg-1·d-1、丹白中剂量组(5.0g·kg-1·d-1)、丹白高剂量组(10.0g·kg-1·d-1)，每组15只。造模成功后24h开始给药，假手术组与模型组以等量生理盐水灌胃，持续灌胃24d。选取5只大鼠的子宫组织进行HE染色及Masson染色，另选5只大鼠的子宫组织进行子宫腔的通透性评分和AFS评分，另选5只大鼠的子宫组织进行胶原含量测定及TGF-β1/Smad3通路相关蛋白表达情况测定。

1.3.2HE染色观察大鼠子宫组织内膜厚度、腺体数量:给药结束后24h，每组选取5只大鼠进行HE染色处理，将大鼠麻醉后处死，收集双侧子宫组织。将组织置于生理盐水中漂洗干净，采用4%多聚甲醛溶液固定后，经低浓度到高浓度梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后使用切片机进行切片，得到常规病理切片，接着进行苏木素-伊红染色(或HE染色)，具体操作按照说明书进行。封片后于高倍镜下选取5个视野记录子宫内膜腺体及子宫内膜厚度，取平均值即为大鼠子宫内膜腺体数量及子宫内膜厚度。

1.3.3子宫腔通畅性及AFS评分测定:选取5只大鼠参考文献[10]测定大鼠子宫腔的通透性评分，将各组大鼠子宫摘除后置于白色滤纸上，用1mL注射器吸入约0.5mL的亚甲蓝溶液，由子宫卵巢端向宫腔内推入，根据推入亚甲蓝溶液所需的力度及溶液的的体积进行综合评分，子宫通畅性良好记为0分，通而不畅记为1分，完全不通畅记为2分。参考美国生育协会AFS评分标准[11]评价大鼠的子宫粘连程度，分值越高粘连越严重。

1.3.4Masson法检测大鼠子宫内膜纤维化程度:每组选取5只大鼠，对子宫组织行Masson染色，将石蜡切片脱蜡、苏木精染核、Masson丽春红酸性复红液染色、冰醋酸溶液浸洗、磷钼酸水溶液分化、苯胺蓝染色、经酒精冲洗、二甲苯透明、封片，具体操作按照说明书进行。封片后于高倍镜下选取5个视野计算子宫内膜纤维化面积比，即子宫内膜纤维化面积与所选视野总面积之比。

1.3.5ELISA法检测大鼠子宫组织胶原含量:将50mg大鼠子宫组织剪碎后加入胃蛋白酶(5mg/mL)和三氯乙酸(0.5moL/L)消化(4℃，过夜)，离心后的上清液中含有可溶性胶原，沉淀中含有不溶性胶原，根据羟脯氨酸试剂盒说明书的要求测定并计算上清液中羟脯氨酸的含量，以羟脯氨酸的含量反映可溶性胶原的含量。另取50mg大鼠子宫组织剪碎后加入水解液，再根据羟脯氨酸试剂盒说明书的要求进行测定，以得出总胶原含量，二者的差值即为不溶胶原含量。

1.3.6Western blot法检测大鼠子宫内膜TGF-β1/Smad3通路相关蛋白表达情况:每组选取5只大鼠，采用蛋白提取试剂盒提取大鼠子宫内膜组织中的总蛋白，参照BCA试剂盒说明书的要求测定蛋白浓度，8%分离胶及5%浓缩胶进行电泳，湿转法转移至PDVF膜上，脱脂奶粉(5%)封闭1h后添加兔抗鼠TGF-β1、Smad3、Smad7一抗、内参GAPDH(1∶500)4℃孵育过夜，用TBST洗涤后添加羊抗兔IgG二抗(1∶5000)，室温孵育2h。采用蛋白成像凝胶仪对TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白水平进行定量分析。

2 结 果

2.1大鼠子宫组织病理形态比较:HE染色切片显示，假手术组大鼠宫腔通畅、腔壁组织结构清晰完整；与假手术组相比，模型组大鼠宫腔消失、腔壁组织呈现粘连状态、较多炎性细胞呈现浸润状态；与模型组相比，丹白颗粒各剂量组均有一定的改善，其中高剂量组宫腔较为通畅。见图1。

图1 大鼠子宫组织HE染色结果(×400)

2.2丹白颗粒对大鼠子宫内膜厚度、腺体数量、子宫通畅性、AFS评分的影响：与假手术组相比，模型组大鼠子宫内膜厚度及腺体数量显著降低，子宫通畅性评分、AFS评分显著升高(P<0.05)；与模型组相比，丹白颗粒各剂量组大鼠子宫内膜厚度及腺体数量显著升高，子宫通畅性得到缓解(P<0.05)，且呈现一定的剂量效应关系。见表1。

表1 丹白颗粒对大鼠子宫内膜厚度腺体数量子宫通畅性的影响

2.3丹白颗粒对大鼠子宫内膜纤维化程度和子宫胶原含量的影响：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠子宫内膜纤维化面积及子宫组织中的不可溶性胶原含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，丹白颗粒各剂量组子宫内膜纤维化面积及不可溶性胶原含量显著降低(P<0.05)，并呈现一定的剂量效应。见图2、表2。

图2 大鼠子宫组织Masson染色结果(×400)

表2 各组大鼠子宫内膜纤维化程度及胶原含量比较

2.4丹白颗粒对大鼠子宫内膜TGF-β1/Smad3通路蛋白表达的影响：与假手术组相比，模型组大鼠子宫内膜TGF-β1、Smad3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，Smad7蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比，丹白颗粒低、中、高剂量组大鼠子宫内膜TGF-β1、Smad3蛋白表达水平呈降低趋势(P<0.05)，Smad7蛋白表达水平呈升高趋势(P<0.05)，丹白颗粒各剂量组呈剂量依赖性，见图3、表3。

表3 各组大鼠子宫内膜TGF-β1/Smad3蛋白相对表达

图3 各组大鼠子宫内膜TGF-β1/Smad3蛋白相对表达

3 讨 论

IUA主要发生在育龄期女性，是常见的妇科疾病之一，且发病率逐年上升。子宫基底膜受到损伤后导致基层暴露，创面的胶原蛋白、炎症因子等会渗出，宫腔内壁发生一定的接触，在子宫内膜修复过程中会形成纤维带，进而产生IUA，常会导致闭经、少经、痛经等不良症状[12]，子宫内膜损伤引起的宫腔形态异常会导致不孕、胚胎发育停止、产后大出血、胎盘粘连等不良妊娠症状，对于女性的身体健康及生育产生重大影响[13]。子宫内膜损伤是发生IUA的主要原因，因此建立有效的IUA大鼠模型在IUA疾病发生发展研究中占有重要地位。Kong[14]及王显[15]等通过机械性刮除及感染性损伤建立大鼠IUA模型效果较好，IUA模型大鼠的子宫内膜纤维化程度加深、腺体数量显著减少、TGF-β1表达显著升高。本研究通过子宫内膜搔刮后用脂多糖加重感染的多重损伤法构建大鼠模型，研究结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠腔壁组织呈现不同程度的粘连状态，子宫内膜厚度及腺体数量显著降低，子宫通畅性评分、AFS评分、子宫不可溶性胶原含量、子宫内膜纤维化面积显著升高，表明模型组大鼠子宫受损严重、宫腔粘连严重、内膜纤维化程度较深，揭示IUA模型构建成功。

研究发现IUA与子宫内膜纤维化、宫腔损伤、热淤内结等联系密切，子宫内膜受损后，在修复过程中会促进细胞外基质的产生、成纤维细胞的分泌及不溶性胶原的转化，导致宫腔内较多纤维瘢痕组织的生成，促进子宫内膜的纤维化，进而产生宫腔内壁粘连[16]，基于丹白颗粒的活血化瘀、祛湿止痛的功效，本文用丹白颗粒处理IUA大鼠，研究丹白颗粒对IUA的治疗效果。研究结果显示，与模型组大鼠相比，经过丹白颗粒处理过的大鼠子宫内膜厚度、腺体数量有一定的回升，子宫通畅性、子宫内膜纤维化程度得到缓解，不可溶性胶原含量显著降低，表明丹白颗粒具有缓解子宫受损及子宫内膜纤维化的作用，对于治疗IUA可能具有较好的疗效，但其具体机制尚不清晰。

Zhang[17]等研究发现阿司匹林通过抑制TGF-β1-Smad2/Smad3通路抑制子宫内膜纤维化，进而发挥其对IUA的治疗作用，李灿宇[18]等研究发现TGF-β1是有效的促纤维化因子，可促进细胞外基质及成纤维细胞的生成，可介导组织纤维化和纤维瘢痕组织的生成，在多种纤维化疾病中呈现高表达，Smad3是TGF-β1的转录调节因子，Smad3的高表达可促进纤维细胞胶原的合成，加重宫腔粘连程度。Smad7的表达增加会阻断TGF-β1与Smad3的结合，进而起到抗纤维化的作用。本研究结果显示，与模型组相比，丹白颗粒低、中、高剂量组Smad7蛋白表达水平呈升高趋势，TGF-β1、Smad3蛋白表达水平呈降低趋势，与相关研究结果一致，表明丹白颗粒可能通过抑制TGF-β1/Smad3通路活化，进而发挥抗IUA子宫内膜纤维化的作用。

综上所述，丹白颗粒可有效缓解IUA大鼠引起的子宫内膜纤维化程度，可能与抑制TGF-β/Smad通路有关，但是本研究未进行通路抑制剂及激活剂进行验证试验，仍需深入研究。