p53信号通路在半枝莲总黄酮预处理大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

于淼，李铁成

(锦州医科大学附属第三医院麻醉科，辽宁 锦州 121000)

冠状动脉再通技术的普及使心肌梗死患者的生存率大幅提升，但缺血心肌恢复灌注后所引发的额外损伤，即心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury， MI/RI)，又可导致先前存活的心肌组织损伤加重，降低患者的生存质量[1]。MI/RI是多因素参与的复杂病理生理过程，多项研究证实，细胞调亡在此过程中扮演着重要的角色[2-4]。最新研究表明，转录因子p53可有效调节线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放，并可通过凋亡信号通路激活调控因子完成转录或直接在线粒体膜上与B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白相互作用而诱导细胞凋亡[5，6]，导致组织细胞损伤。

半枝莲总黄酮(Scutellariabarbataflavonoids，SBF)是从半枝莲中提取的黄酮类化合物。研究表明，SBF具有抗肿瘤、抗病毒、解热、保肝、抗氧化及免疫调节等多种功效，并可使神经细胞的凋亡降低[7-9]，具有极大的研究及应用价值。本研究通过探讨SBF在MI/RI中的作用并分析其可能的作用机制，从而进一步明确SBF的器官保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雌性SD大鼠50只，体质量(230±20)g，由锦州医科大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂与设备

SBF(陕西森元生物科技有限公司，中国)；氯化硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium，NBT)(苏州海恒生物医药有限公司，中国)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)检测试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司，中国)；Bcl-2、β-肌动蛋白(β-actin)一抗和二抗(上海博湖生物科技有限公司，中国)；BCA(bicinchoninincacid)蛋白浓度检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，中国)；p53蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)检测试剂盒(北京盛科博源生物科技有限公司，中国)；原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测、核蛋白提取试剂盒(亚科因公司，中国)。呼吸机DH-105、床边监护仪BSM-7105K(浙江大学医学仪器厂，中国)；超声波破碎仪VCX-130(美国Sonics公司，美国)；生物显微镜DM500、切片机RM2235、烤片机KPJ-435(徕卡，德国)；EnduroTMVE10垂直电泳系统(莱伯特公司，美国)、化学发光凝胶成像系统FluorChem E(Alpha公司，美国)；低速自动平衡离心机Ldz4-1.2(北京雷勒尔离心机有限公司，中国)；其他由锦州医科大学基础药理学实验室提供。

1.3 实验分组

将50只SD大鼠按照随机数表法随机分为5组，每组10只。(1)假手术组；(2)MI/RI组；(3)低剂量组(SBF 30 mg/kg)；(4)中剂量组(SBF 75 mg/kg)；(5)高剂量组(SBF 140 mg/kg)。实验动物术前均用普通饲料及饮用水饲养，采用灌胃方式对低、中、高剂量组的30只大鼠给予对应剂量的SBF，1次/d，连续1周。

1.4 MI/RI模型建立

术前禁食12 h，不禁水。20%乌拉坦(150 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰卧位固定于实验台上，连接心电图机，行气管插管，连接呼吸机(潮气量2 ml/100 g，频率60次/min，吸呼比1∶3)。沿胸骨左缘3、4肋间，剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，开胸，暴露心包，剔除心包膜。假手术组只穿线不结扎处理，其余4组均在左冠状动脉前降支发出2 mm处，用5-0手术缝合线进行结扎，立即可见心电图ST段抬高，30 min后减掉结扎线，恢复血液灌注并维持再灌注60 min。再灌注后ST段回落50%即造模成功。

1.5 采集标本

造模完成后，立刻从颈总动脉取血并将心脏完整摘除。动脉血放置室温静置30 min，离心(3 000转/min，10 min)，将血清置于EP管内，标记后存放至-80℃冰箱保存备用待检。各组随机选取5个心脏组织，将心脏分为两部分，一部分固定于4%多聚甲醛溶液内，4℃冰箱保存；另一部分置于-80℃冰箱内待检。各组中剩余的5个心脏组织，保留左心室，剔除其余组织，放置于-20℃冰箱中冷冻1 h待检。

1.6 检测实验指标

1.6.1 酶联免疫吸附试验测定LDH和CK-MB 取离心后的血清，加样，滴加对应试剂，封板，37℃温育30 min，洗板5次，添加显色剂，避光孵育15 min，加入终止液，酶标仪比色。

1.6.2 心肌梗死面积测定 将-20℃冰箱冷冻1 h后的心肌组织取出，沿心肌带走形切成5个等厚的5 mm切片，0.5%NBT溶液37℃水浴浸染30 min。NBT染色后，暗紫色区域为正常心肌，砖红色或灰白色区域为梗死心肌。测量心肌梗死面积采用Image-Pro Plus 6.0软件。心肌梗死面积(%)=梗死部分面积/总心肌面积×100%。

1.6.3 Western blot检测蛋白表达 取出保存于-80℃冰箱内的心肌组织，融化，剪碎，提取核蛋白，BCA试剂盒检测蛋白定量。电泳，转膜，封闭，洗膜。加入Bcl-2(1∶2 000)及β-actin(1∶5 000)一抗孵育，4℃过夜，加入羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗，增强化学发光成像。Image J软件行条带灰度值分析，计算目标蛋白表达量。p53、Caspase-3抗体检测同前。

1.6.4 TUNEL染色 将固定于4%多聚甲醛中的心肌组织行脱水、透明、包埋、切割，制成石蜡切片。行TUNEL染色，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗、暗湿盒孵育、洗涤、二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)避光显色、苏木素复染，光镜下观察，拍照。采用Image-Pro Plus 6.0软件计算凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞个数/总细胞个数×100%。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组血清LDH、CK-MB的含量比较

与假手术组比较，MI/RI组、SBF各剂量组LDH和CK-MB含量均明显增加(P<0.01)；与MI/RI组比较，SBF各剂量组LDH和CK-MB含量显著下降(P<0.01)；与SBF低剂量组比较，中、高剂量组LDH、CK-MB含量显著下降(P<0.01)；与SBF中剂量组比较，高剂量组LDH、CK-MB含量下降(P<0.01或P<0.05；表1)。

表1 各组LDH和CK-MB含量比较

2.2 各组心肌梗死的面积比较

假手术组均为暗紫色，无明显梗死发生。与假手术组比较，MI/RI组心肌梗死面积显著增加(0.80%和37.21%，P<0.01)；与MI/RI组比较，SBF各剂量组均有明显红染梗死灶，SBF低、中、高剂量组梗死面积呈剂量依赖性显著下降(27.45%和16.08%和8.00%，P<0.01或P<0.05；图1)。

图1 各组心肌梗死的面积比较Figure 1 Comparison of myocardial infarction area between each group (n=5)A: NBT staining; B: quantitative analysis results. NBT: nitroblue tetrazolium; MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury. Compared with sham group, #P<0.05, *P<0.01; compared with MI/RI group, △P<0.01; compared with low dose group, ▲P<0.01; compared with middle dose group, ☆P<0.01.

2.3 各组p53、Caspase-3、Bcl-2蛋白的表达比较

与假手术组比较，MI/RI组p53和Caspase-3表达显著上调，Bcl-2表达显著下调(P<0.01)，SBF各剂量组p53和Caspase-3表达升高(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2表达下降(P<0.01)；与MI/RI组比较，SBF低、中、高剂量组p53和Caspase-3表达显著下调，Bcl-2表达显著上调(P<0.01)；与SBF低剂量组比较，中剂量组p53、Caspase-3和Bcl-2表达差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量组p53和Caspase-3表达明显下调，Bcl-2表达上调(P<0.01)；与SBF中剂量组比较，高剂量组p53和Caspase-3表达大幅减低，Bcl-2表达大幅上升(P<0.01；图2)。

图2 各组p53、Caspase-3、Bcl-2蛋白的表达比较Figure 2 Comparison of p53, Caspase-3 and Bcl-2 proteins expression between each group (n=5)A: Western blot; B: quantitative analysis results. MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury. Compared with sham group, #P<0.05, *P<0.01; compared with MI/RI group, △P<0.01; compared with low dose group, ▲P>0.05, ☆P<0.01; compared with middle dose group, ★P<0.01.

2.4 各组心肌细胞调亡比较

与假手术组比较，MI/RI组心肌细胞凋亡率明显上升(15.10%和43.82%，P<0.01)，SBF各剂量组细胞凋亡率也显著增加(P<0.01)；与MI/RI组比较，SBF低、中、高剂量组细胞凋亡率呈剂量依赖性下降(35.91%、32.01%和22.67%，P<0.05，P<0.01；图3，4)。

图3 各组心肌细胞凋亡TUNEL染色结果Figure 3 TUNEL staining results of myocardial cell apoptosis between each groupTUNEL: terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling; MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury.

图4 各组心肌细胞调亡率比较Figure 4 Comparison of myocardial cell apoptosis rate between each group (n=5)TUNEL: terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling; MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury. Compared with sham group, *P<0.01; compared with MI/RIgroup; #P<0.01; compared with low dose group, △P<0.05; compared with middle dose group, ▲P<0.01.

3 讨 论

再灌注损伤时，多因素协同作用使蛋白酶活性变化，细胞膜的通透性升高，影响心肌细胞代谢的关键蛋白酶LDH和CK-MB从胞浆入血，使其在血清中的含量升高，故常作为敏感指标反映心肌细胞受损程度[10,11]。同时，相关蛋白的表达也随心肌损伤发生复杂变化，调控细胞凋亡。p53蛋白从内源性途径启动细胞凋亡，激活Bcl-2家族蛋白，促使线粒体释放细胞色素C，进一步激活Caspase-3，引发级联反应，诱导细胞凋亡[12-15]。

SBF的主要成分为野黄芩苷，研究证实，在肿瘤治疗及脑损伤保护中具有抑制细胞凋亡作用[16,17]。本实验结果显示，SBF对心肌缺血/再灌注损伤具有一定的保护功效。LDH和CK-MB含量、梗死面积及细胞凋亡率均能显著证实SBF的保护作用。与假手术组比较，MI/RI组p53和Caspase-3表达水平上调，Bcl-2下调，说明在MI/RI时可能发生了由p53介导的Caspase-3凋亡途径，诱导相应细胞凋亡；相比于MI/RI组，SBF各剂量组p53、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达变化明显，且高剂量组p53、Caspase-3和Bcl-2蛋白变化显著，可能与SBF预处理抑制p53表达诱导的细胞凋亡途径有关。

综上，半枝莲的活血化瘀功效在心脑血管疾病治疗中具有独特优势，但其有效化学成分复杂，目前的研究热点依旧是有效成分的分析和提取。本实验表明，SBF可抑制由p53通路诱导的细胞凋亡途径，产生心肌保护功效。同时，MI/RI发病机制较多，并且各通路间相互协同，目前对其具体保护机制尚不能明确。本实验仅从p53信号通路角度，探讨SBF与MI/RI的关系，其具体机制还需进一步论证。