病理检验过程中石蜡切片及HE染色常见问题及对策分析

梁津杰

石蜡切片与HE染色是病理检验切片处理的主要技术手段，其处理效果对于临床诊断有着直接的影响，质量上乘的切片才是实现正确诊断的根本要求，尤其是在临床诸多重大疑难病理的诊断上，必须保障高质量的处理切片，才能获取准确诊断结果，成为临床诊疗的可靠依据。但在临床实践中切片处理质量差等问题始终无法避免，因此，本次分析意在总结病理检验中石蜡切片与HE染色的常见问题，并根据每个问题出现的原因探究针对性解决对策，以便提高石蜡切片与HE染色质量。具体来讲，本次选择我院2018年10月—2019年10月由笔者质控的约4 200张病理切片作为研究对象，详细分析其切片处理以及HE染色上存在问题及具体表现，并基于问题出现原因给出解决对策，以供参考与借鉴。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次选择我院2018年10月—2019年10月由笔者质控的约4 200张病理切片作为研究对象。

1.2 石蜡切片及HE染色常见问题及原因

1.2.1 石蜡切片的常见问题及原因 （1）皱褶及折叠，切片内部或者边缘出现组织重叠。该问题产生的原因有切片问题也有漂片问题，切片时如组织较硬，有钙化灶或者异物存在，切片刀不够锋利，均容易形成皱褶，蜡块冷却不足、较软也容易出现皱褶，漂片时水温过低，组织切片在温水中不能完全展开，也会形成皱褶。 （2）切片散开，漂片过温水的时候，切片向四周扩大，甚至整张切片破裂。该问题一般由于温水水温过高导致，或者由于组织脂肪较多，脱水不好，脂肪在温水中更容易散开。 （3）刀痕，该问题产生一般由于组织内含有较硬的成分，如果结石残渣，钙化点，肺粉尘沉积等，或者石蜡中有杂质，使切片刀形成缺口，导致镜下组织出现组织缺损的细小笔直纹路。 （4）切片不完整，需要诊断的病灶区域没有切出或切面不完整，会导致诊断困难或者漏诊。该问的题产生有以下几点，取材医生取材时，组织切面不平整，技术员包埋时组织没有按平，如一个包埋盒里有多个组织的，这一步显得尤为重要，切片时组织蜡块没有修到最大切面，这些方面都会导致切片不完整。 （5）筛孔与划痕，镜下出现很多大小不等的组织空洞，其内不见细胞结构，边缘不整齐。该问题是由于粗修蜡块的时候，修片进刀幅度过大，动作过快，使组织切面粗糙不平，或者出现切面多处发白，从而造成切片出现大小不一的空洞。 （6）切片厚薄不均或跳片，切片上出现肉眼可见的平行的厚薄不等区域或HE染色后出现明显的平行分布的深染或者浅染区。该问题产生的原因有以下几点，切片机刀架卡位没卡紧；刀架变形，导致刀片夹不紧；蜡块包埋盒表面有多余石蜡，切片机蜡块夹头里有碎蜡，使蜡块没有夹紧；包埋时加蜡不足或过程中石蜡漏出，使包埋盒与组织相连不够紧密，或者形成空心蜡块；组织本身较硬及切片过快。 （7）颤痕，镜下出现比较密集的平行的裂纹，主要出现在胃肠道黏膜腺体、子宫内膜、淋巴结。该问题出现主要因为蜡块切片温度过低，组织发脆导致，切片速度过快，有时也会引起。 （8）组织发白，不能切出完整切片，该问题出现主要因为组织脱水不良，脱水良好的组织肉眼应该呈半透明状，如部分呈白色，甚至有水分渗出，说明组织脱水不良，没有石蜡浸入，缺少石蜡的支撑，难以切片。 （9）蜡块的水反渗，某些蜡块在较多水的冰盘上放置久了，会出现组织切面向外膨胀，发白，导致不能切片，该问题出现是由于组织脱水不足导致水反渗。 （10）秋冬季静电大，难以切片，由于秋冬季湿度很低，容易产生静电，静电会使切片难度大增，切片会相互粘附、邹缩成团，不能展开成片。 （11）蜡块内部组织周边出现或多或少的裂纹，主要因为某些石蜡质量问题，或者冷却过快，或者在石蜡没完全冷却的情况下强行把包埋模撬离，都会使蜡块内部形成裂痕。

1.2.2 HE染色常见问题及原因 （1）苏木精染色过淡，导致细胞核染色出现暗淡、苍白表现。该问题主要由使用苏木精染液中切片停留时间过短造成；分化时间过长；或苏木精存在过度氧化问题，导致染色能力受到影响，不符合使用标准[1]。 （2）细胞核有红色或棕色改变情况。该问题主要因苏木精染液有过度氧化情况出现，或在使用苏木精染色过程中切片返蓝不足，或是伊红染色问题导致细胞核被伊红覆盖。 （3）伊红着色过淡，该情况主要因伊红溶液pH值超过标准要求，也可因切片过薄，染色过程中蓝化液残留过度，或因在乙醇脱水环节停留过长时间。 （4）显微镜观察中切片有水珠，或肉眼观察有雾气，这种情况主要是切片在乙醇处理后未充分进行脱水，导致封固后水分无法排出。 （5）脱蜡后发现切片有白色斑点，该情况出现的主要原因是烤片环节温度过低，烤片时间不足，切片未充分烤干；或二甲苯在切片停留时间过短；或二甲苯使用过久，导致脱蜡不完全[2]。 （6）苏木精染色过深，挤占细胞质位置。该类问题主要受三种情况影响，苏木精使用过程中分步骤处理时间过短；或切片太厚；或切片在苏木精染色环节停留时间过长；或苏木精pH值过高，细胞质共染。 （7）切片上有蓝黑沉淀物质出现，苏木精染色环节出现金属膜，附着在切片上。 （8）细胞质过染情况，由于染色过程中伊红溶液浓度过高；伊红染色后对切片进行乙醇脱水处理时间较短；伊红染色时间过长[3]。 （9）切片位于光镜时聚焦困难，封固过程中封固剂残留在盖玻片上。 （10）HE染色不均匀，有斑点或大面积不均匀存在，散布在切片周围，影响细胞核染色质的均匀分布。 （11）切片中出现裸核改变，这是一种有色素样点状晶体存在或黑色光滑细胞核存在情况，主要是因切片在封片前较长时间处于空气当中，导致二甲苯发挥干净，切片过于干燥[4]。 （12）细胞核呈灰蓝状态，由于染色过程中组织温度过高；或固定时间不充分；或石蜡过长时间的停留；或未充足固定后立即进行乙醇脱水处理[5]。

2 讨论

本次研究中统计了石蜡切片及HE染色中常见的23种问题，其中每种类型出现的频率不一致，但这23种问题对于临床诊断都有着直接的影响。而且在现有研究中也充分证明石蜡切片处理以及HE染色中切实有问题存在，尤其是染色环节，染色过深、过淡、不均匀情况频繁出现，严重影响最终染色质量，并干扰临床医生对病理的判断。本次研究中，对于每种问题的解决策略如下。

2.1 石蜡切片问题

（1）出现皱褶及折叠，如是组织问题，如钙化灶，有时难以避免，如是刀片问题，则更换新刀位，如是漂片水温问题，则调节水温到适合温度，漂片时间适当，使切片能完全展开，漂片温度一般比石蜡熔点低10℃左右，但具体温度要根据自己科室作出微调。 （2）如切片散开，应该及时调节漂片机水温，使水温能够让组织展平，又不至于扩大或破裂，如是含脂肪组织较多，可以缩短漂片时间，或者不漂温水，以保证组织的完整性。 （3）出现较多刀痕时，应该更换新刀位，但对于某些组织，如钙化组织、肺淋巴结组织，难以不出现刀痕，建议在不影响诊断的情况下，可以酌情忽略。 （4）出现切片不完整，必须规范取材、包埋、修片这几个环节的操作，医生取材尽量使组织块切面平整，包埋时把标本按平，含有多块组织的，每块组织均要按平，粗修时要观察蜡块是否已经暴露出最大切面，必要时要对蜡块进行重新包埋。 （5）出现筛孔与划痕，在修片的过程中应把握好进刀的幅度，一般在粗修模式下，设置厚度为5~10 μm，在修片的最后再细修3~5刀，使蜡块切面光滑，尽量少出现毛糙及白点。 （6）出现切片厚薄不均或跳片，检查仪器的卡位是否卡紧，如果是仪器问题，如刀架变形、卡位不紧，应及时维修，包埋不牢固或者空心的蜡块应从新包埋，遇到较硬组织时，可以更换新刀位，稍微降低切片轮转速度，或者让蜡块稍微复温再切片，对跳片有比较好的改善，平时要注意保养切片机，以免碎蜡碎屑藏积使仪器卡位不紧。 （7）出现颤痕，可以用刚开始融化的冰盘作为蜡块的冷却台，此时温度接近0℃，再降低切片速度，能明显减少颤痕出现的几率，如用制冷台，应调节温度到0℃，但笔者建议用自己制作的冰盘冷却，效果更好。 （8）出现组织发白，应该从组织固定、脱水方面进行探讨，新鲜组织必须在离体后半小时内切开固定，固定时间足够，小标本固定时间大于8小时，大标切开本固定时间大于16小时，取材标本体积不能超过2 cm×1.5 cm×0.3 cm，脱水程序要摸索出适合自己科室的条件。 （9）蜡块的水反渗，蜡块不能在水较多的冰面上过长时间，可以在切片前3~5分钟再放到冰面进行冷却，基本可以避免该情况发生。 （10）秋冬季静电大，难以切片，此时可以增加室内湿度，购买专用的切片加湿器，或者改装家用加湿器，加装管道，引管到蜡块夹头旁，调节雾气的大小，使蜡块轻微湿润，即可除去静电影响，或者在冰面加水，使冰面湿润，也可减少静电影响，但切片时注意不能修片太多，一般前3~5张切片效果好，往后的切片会逐渐出现皱缩成团的现象。 （11）蜡块内部组织周边出现裂纹，如是石蜡质量问题，应该更换批次或者更换牌子，刚包埋好的蜡块，石蜡仍是液态，应平放在冷却台上自然冷却，不应快速置于冰水当中，待完全凝固后再分离包埋模，可明显减少裂纹出现。

2.2 HE染色问题

（1）现苏木精染色过淡问题，应重新进行切片染色，延长苏木素浸泡时间，缩短分化时间，也可在染苏木素前把片浸泡在1.5%醋酸溶液中，调节切片的pH值，使苏木素对细胞核染色的针对性增强，同时可以降低细胞质的共染，其中1.5%冰醋酸也可以作为苏木素中冰醋酸的补充，可稳定苏木素的pH值，延长苏木素的使用寿命。 （2）出现细胞核有红色或棕色改变时，需要在染色前检查苏木精的质量情况，如果存在过度氧化以及变质等问题，及时进行更换，染色过程中必须经过返蓝液浸泡，保障蓝化时间充足。 （3）对于伊红着色过淡问题，染色前测试伊红溶液的pH值，伊红溶液pH值必须低于5，尽量控制在4.6~5.0之间，以便保障染色效果。但水溶性伊红pH值容易受外界影响，如醋酸的挥发，残余自来水的混入等，均会使伊红的pH升高，影响着色效果，可以更换为0.2%的醋酸化伊红醇溶液[6]，在染伊红前先浸泡95%乙醇，同时，需要切片充分蓝化后，彻底清洁其中的弱碱性溶液后再进行下一步操作；测量切片厚度是否太薄，避免乙醇脱水时间过长稀释其中颜色[7]。 （4）对于显微镜下观察切片有水珠情况，发现后将盖玻片拿掉，溶解封固剂，可在无水乙醇前添加一缸苯酚+TO/二甲苯溶液，取出残余水份，并连续将切片放置在新鲜无水乙醇中，脱水完成后进行再次封固。 （5）对于切片脱蜡后出现白色斑点问题，必须保障充分烘烤，除去切片中的水分；对于烘烤时间过长问题，切片可能出现脱落，后续处理无法补救；二甲苯脱蜡时间要充足，如出现脱蜡不完全，可以延长时间或加温，还需要定期更换脱蜡二甲苯，一般500 mL二甲苯处理500以内张切片为宜，此外，如果因二甲苯时间过长短导致斑点，可通过脱色、漂白重新进行脱蜡染色[8]。 （6）对于苏木精染色过深问题，如果因切片过厚导致，可重新进行切片；但并非切片过厚造成，则需要重新进行染色，缩短苏木素染色或者延长分化时间。 （7）对于切片上有蓝黑沉淀物质问题，需要在每次染色前认真检查与过滤苏木精，尽量使用处于半氧化状态的苏木精，避免产生金属膜。 （8）对于细胞质出现分化不足或过染问题，可通过缩短伊红染色时间，或者延长伊红后脱色乙醇的时间；若因切片过厚，则需要调整切片厚度[9]。 （9）对于切片位于光镜时聚焦困难问题，需要移出盖玻片，使用新的盖玻片进行重新密封，并严格检查切片密封效果，如果为密封方法问题，需要及时进行调整。 （10）对于HE染色不均匀问题，细胞核染色不均多为固定不足引起，如外层细胞核染色正常，内层细胞核染色偏浅或灰染，应规范组织固定流程，使组织固定充分，细胞质染色不均，多数由于伊红分化时没有充分抖动，造成脱色不均引起，改成醇溶性伊红的染色程序，能有效的减少细胞浆染色不均的情况[10]。 （11）对于切片中出现裸核改变问题，先拿掉盖玻片，溶解封固剂，重新进入到脱水环节、封固环节，使切片处于湿润状态，避免其过于干燥问题[11]。 （12）对于细胞核呈灰蓝状态问题，从理论层面来讲，这种情况主要是因组织与石蜡没有充分接触，或在温度较高蜡液中停留较长时间，其中对于第一种情况，需要将组织用塑料包埋盒包装放置在冷空气内进行冷凝，冷凝后重新加热，融化石蜡；而第二种情况需要在组织固定良好情况下，重新进行脱水处理[12]。

综上所述，石蜡切片与HE染色作为临床病理检验不可缺少的技术手段之一，对于病理检测结果质量的影响关系到临床诊断的科学性以及准确性，因此，面对当前石蜡切片处理以及HE染色问题频出的情况，本文对常见的问题进行了系统的总结，并针对每种问题出现的原因进行了解决对策分析，希望该问题能够引起医院以及临床的重视，在临床实践当中不断补充，总结丰富经验，科学应对石蜡切片处理以及HE染色中出现的突发情况，从而有效提升病理检验准确性[13]。