circRIPK2在鸡骨骼肌细胞增殖分化中的调控作用

张 敏，王芷筠，李 戡，聂庆华

(华南农业大学 动物科学学院/农业部鸡遗传育种与繁殖重点实验室，广东 广州 510642)

人类基因组约70%～90%可以转录成RNA，然而仅有不足2%的基因具备编码能力[1]。众多不具备编码能力的RNA都被归作转录噪音或者剪接副产品。尽管早期研究明确显示非编码RNA(Noncoding RNA，ncRNA)在自然界真实存在，它们的潜在作用仍没有被充分证实[2]。随着20世纪以来计算机技术的迅猛发展，人们发现这些非编码RNA在不同的生理或者病理过程中发挥着重要的调控作用[3]。环状 RNA(Circular RNA，circRNA)是内源性非编码RNA家族的一员，大概40年前，研究人员逐渐关注这种具有共价闭环结构的新兴RNA分子。研究表明，circRNA在细胞中广泛分布，和线性RNA相比，不易受RNA外切酶影响，具有更高的稳定性[4]。近年来有关circRNA的生物学功能研究受到广泛关注，其作用方式多种多样，包括作为miRNA海绵、调控亲本基因转录、和蛋白质相互作用、甚至翻译小肽等方式发挥功能[5-8]。目前对circRNA生物学功能的理解仍处于早期，除了对衰老、癌症等疾病具有重要调控作用外，circRNA在肌肉发育过程中也具有重要作用。通过对不同动物的骨骼肌和成肌细胞进行circRNA测序，发现在肌肉中高表达且具有调控作用的多个circRNA，例如circFUT10、circLMO7、circRBFOX2、circFGFR4 等，它们通过结合miRNA参与成肌细胞的增殖分化进程[9-12]；另外也有研究发现circZNF609可以翻译微肽，且调控成肌细胞的增殖过程[8]。

RIPK2是RIP家族的一员，RIPK2的N端包含1个丝氨酸/苏氨酸结构域，C端为半胱氨酸蛋白水解酶募集域[13]，研究表明，RIPK2在维持免疫系统稳态或者调节脂肪代谢等方面发挥重要作用[14-15]。Ouyang等[11]前期对不同发育时期鸡的骨骼肌进行circRNA测序，通过对测序结果的分析筛选，发现circRIPK2在3个时期差异表达，因此推测circRIPK2可能在鸡肌肉发育过程中具有重要作用。本研究利用PCR扩增、Sanger测序验证circRIPK2的存在，同时利用定量PCR、EdU试验、流式细胞术等探究circRIPK2对鸡原代成肌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡胚来源于珠海市裕禾农牧有限公司。

主要试剂：DNA抽提试剂盒购自OMEGA公司；RNA反转录试剂盒购自莫纳生物科技有限公司；荧光定量PCR酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；环状RNA过表达载体pCD2.5-ciR购自吉赛生物科技有限公司；核质分离试剂盒、FastDigestBamHI、FastDigestEcoRI购自 Thermo 公司；RNAiso Plus购自TAKARA公司；凝胶DNA小量回收试剂盒、低内毒素质粒抽提试剂盒均购自Magen公司；转染试剂 Lipofectamine 3000 购自 Invitrogen 公司；Opti-MEM无血清培养基、RPMI1640细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、马血清均购自Gibco公司；EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡原代成肌细胞的分离与培养 采集11胚龄鸡胚的腿肌组织，用手术剪刀和镊子剔除可见的骨骼和皮肤组织，剩余肌肉组织剪至肉糜状，然后用胰蛋白酶在37 ℃培养箱内消化15～20 min，用完全培养基(体积分数为20%的胎牛血清+体积分数为79.5% 的RPMI+体积分数为0.5%的青霉素、链霉素)终止消化。使用 70 μm 过滤网过滤后，1 500 r/min离心5 min，用完全培养基对细胞进行重悬、并接种到无菌培养皿中、差速贴壁2次，获取纯化的成肌细胞，细胞在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱内培养。

1.2.2 circRIPK2 过表达载体构建 根据circRNA的测序数据，通过Ensemble数据库下载circRIPK2的基因序列，应用DNASTAR软件设计全长序列的引物(表1)。通过PCR反应获得circRIPK2的全长序列。使用FastDigestBamHI、FastDigestEcoRI酶切PCR扩增产物及pCD2.5-ciR载体，酶切产物纯化后利用T4连接酶连接、22 ℃ 条件下放置 1 h。取 10 μL 连接产物转化至DH5α感受态细胞中，转化完成后涂板，37 ℃培养箱培养12～14 h后挑取单克隆菌落培养，菌液鉴定后，送擎科生物技术有限公司测序，比对circRIPK2基因序列和测序序列，选取结果吻合的单克隆菌落留用。

表 1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.2.3 细胞转染试验 当原代成肌细胞密度 (显微镜视野下的细胞占比)超90%时，将细胞接种于12孔板，RPMI1640完全培养基培养细胞。12孔板细胞密度为70%～80%时，使用转染试剂Lipofectamine 3000转染过表达载体pCD2.5-circRIPK2和对照空载质粒pCD2.5-ciR，转染6 h后更换培养基，待贴壁生长细胞密度为90%～100%时，使用分化培养基(体积分数为2%的马血清+体积分数为97.5%的RPMI+体积分数为0.5%的青霉素、链霉素)诱导成肌细胞分化。

1.2.4 RNA提取及实时荧光定量PCR检测 分别取100 mg不同胚龄和日龄的肌肉组织样品，加入1 mL RNAiso Plus试剂后研磨匀浆。同时收集增殖分化不同时期的成肌细胞,用RNAiso Plus试剂吹打细胞，RNAiso Plus处理后进行总RNA抽提，然后取0.5 μg总RNA，依据Monad反转录试剂盒说明书将其反转录为 cDNA，反转录程序为 37 ℃ 2 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。以反转录生成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，RT-PCR)，PCR 反应体系：上、下游引物各 0.3 μL、SYBR Green qPCR Mix 5 μL、cDNA 1 μL、双蒸水 3.5 μL。PCR 反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 个循环；溶解曲线程序为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。以GAPDH作为内参基因，检测circRIPK2基因、细胞增殖相关标记基因及肌分化标志基因的表达。

1.2.5 EdU 试验、流式细胞术检测细胞增殖 转染过表达载体circRIPK2和pCD2.5-ciR，每组设置6个重复，24 h后收集细胞，用流式细胞仪检测并分析细胞周期变化；转染48 h后参考锐博EdU试剂盒说明书对细胞进行孵育、固定、通透等处理，染色完成后加PBS缓冲液避光保存待用，在荧光显微镜下观察。

1.2.6 核质定位分析 分离原代成肌细胞后用完全培养基培养，待细胞密度达100% 时，使用核质分离试剂盒回收细胞核和细胞质RNA，然后利用RTPCR技术检测circRIPK2在细胞质、细胞核中的表达量。

1.2.7 统计学分析 试验分组中每组包含3个重复，采用GraphPad Prism8软件绘图和数据统计分析，2组数据比较采用t检验分析。

2 结果与分析

2.1 circRIPK2的鉴定及细胞定位

用不同胚龄(11胚龄、16胚龄、1日龄)杏花鸡腿肌进行高通量测序，Ouyang等[11]鉴定发现了13 377个cricRNA，根据上述测序数据，本研究选取在3个时期差异表达的circRIPK2作为候选研究基因，描述了circRIPK2的成环来源示意图(图1)。针对RIPK2接头序列预测位点设计收敛引物、发散引物各1对(表1)，利用反转录后的cDNA、gDNA为模板进行PCR扩增，结果显示只有以cDNA为模板时，发散引物才可以扩增出明亮的条带(图2)。同时Sanger测序结果显示circRIPK2的环化位点真实存在(图3)。使用核质分离试剂盒，分别回收细胞核和细胞质RNA，采用RT-PCR对circRIPK2进行细胞定位，结果(图4)表明circRIPK2在核质中均存在，其中细胞质占比为72%，细胞核占比为28%。

图 1 circRIPK2成环来源Fig.1 The biogenesis of circRIPK2

图 2 circRIPK2收敛引物和发散引物的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of circHIPK2 by convergent primers and divergent primers

图 3 circRIPK2发散引物扩增片段测序结果Fig.3 Sanger sequencing result of PCR product amplified by divergent primers for circRIPK2

图 4 circRIPK2在细胞核与细胞质中的分布Fig.4 Distribution of circRIPK2 in the nucleus and cytoplasm

2.2 circRIPK2的时空表达谱分析

以 11胚龄、16胚龄、1日龄小鸡腿肌的cDNA作模板，通过RT-PCR技术比较不同胚龄circRIPK2的表达水平变化，发现circRIPK2在不同时期表达存在差异(图5A)。同时，试验分析了circRIPK2在原代成肌细胞增殖分化不同时期的表达变化，发现与成肌细胞密度约为50%的增殖期相比，分化期第1天至第6天circRIPK2的表达均显著上调，在分化期第6天circRIPK2表达达到最高水平，这提示circRIPK2可能在细胞分化过程中起重要作用(图 5B)。

图 5 circRIPK2的时空表达谱分析Fig.5 Analysis of the expression of circRIPK2 at different stages

2.3 抑制原代成肌细胞增殖

在原代成肌细胞中过表达circRIPK2，利用RT-PCR技术证实过表达效果显著(图6A)，可进行下一步试验。转染48 h后，和对照组比较，过表达circRIPK2的原代成肌细胞中p21的mRNA表达水平上调20%，而CyclinB2、Cyclin D1、CyclinD2和PCNA的mRNA表达水平分别下调 39%、22%、29%和45%(图6B)。此外，通过流式细胞术检测对细胞周期的影响(图7、图8)，结果表明过表达circRIPK2后，处于S期细胞显著减少,处于G2/M期细胞显著增多(图8)；采用EdU染色检测细胞增殖情况(图9、图10)，对EdU渗入细胞数目进行统计、分析，结果发现过表达circ-RIPK2后，EdU渗入的细胞总数明显低于对照组，细胞增殖水平受到抑制(图10)。以上结果表明circ-RIPK2对成肌细胞的增殖过程具有显著抑制作用。

图 7 过表达circRIPK2对细胞周期的影响Fig.7 Effect of circRIPK2 overexpression on cell cycle progression of chicken primary myoblasts

图 8 过表达circRIPK2后细胞周期的统计结果Fig.8 Statistical results of cell cycle after overexpression of circRIPK2

图 9 EdU试验检测过表达circRIPK2对鸡原代成肌细胞增殖能力的影响Fig.9 Effect of circRIPK2 overexpression on the proliferation rate of chicken primary myoblast detected by EdU assay

图 10 过表达circRIPK2后EdU试验的统计结果Fig.10 Statistical results of EdU assays after overexpression of circRIPK2

2.4 circRIPK2促进原代成肌细胞分化

转染过表达载体pCD2.5-circRIPK2、pCD2.5-ciR至鸡原代成肌细胞中，待细胞密度为90%～100%时，将培养基更换为分化培养基以诱导成肌细胞分化。诱导分化第2天提取细胞总RNA并进行RT-PCR。试验结果显示过表达circRIPK2后肌分化标记基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表达水平显著上调39%、56%和25%(图 11)。

图 11 过表达circRIPK2后肌分化标记基因表达量变化Fig.11 Expression changes of the myoblast differentiation marker genes after overexpression of circRIPK2

3 讨论与结论

作为非编码RNA家族的重要成员，circRNA广泛参与基因表达调控和疾病发生过程[16-17]。有证据表明circRNA不但在动物骨骼肌中例如牛骨骼肌、家禽骨骼肌、小鼠骨骼肌、猪骨骼肌等大量存在，而且具有较高的表达水平[11, 18-21]。这表明除了生肌调控因子、成肌增强因子、PAX家族等调控骨骼肌发育过程之外，circRNA在调控肌肉发育过程中也扮演重要角色[22-24]。多项研究发现，骨骼肌中的circRNA可通过作为miRNA海绵来调控骨骼肌的生长发育[25]。根据前期测序，本研究筛选出在3个时期差异表达的候选环状RNA-circRIPK2，并且通过PCR和Sanger测序等技术验证circRIK2由RIPK2基因第4至第9外显子反向剪切形成。RT-PCR发现circRIPK2在3个时期中差异表达，这提示circRIPK2可能在鸡骨骼肌发育过程具有一定的调控作用。

有关circRNA对于成肌细胞的增殖已有多篇文献报道。在家禽骨骼肌中，RBFOX2基因的不同外显子能够环化形成circRBFOX2.2-3、circRBFOX2.2-4，两者均可以吸附miR-1a、miR-206来调控鸡成肌细胞增殖过程[11]。另外，在牛骨骼肌中发现，circLMO7可以充当miR-378a-3p海绵，通过作为竞争性内源RNA来促进成肌增殖[10]。在对circRIPK2研究中，我们发现过表达circRIPK2后，和对照组比较，对细胞增殖有促进作用的相关基因 (CyclinB2、CyclinD1、CyclinD2和PCNA)的mRNA表达水平显著降低，然而对细胞增殖有抑制作用的标记基因(p21)mRNA水平显著上调。同时通过流式细胞术、EdU试验检测其对细胞周期的影响，结果也表明circRIPK2抑制成肌细胞的增殖。

circRNA除了调控肌肉细胞增殖，它对于肌肉细胞的分化也具有重要的作用。Li等[12]研究发现，circFGFR4在牛肌肉中高表达，它可以通过作为miR-107的分子海绵调控WNT3A的表达，从而间接促进成肌细胞的分化。在小鼠中circZfp609可以吸附miR-125b解除对下游靶基因BCLAF1的抑制作用，并且通过影响Myf5和MYOG的表达间接抑制成肌细胞的分化[26]。此外，在羊骨骼肌中，circFOXO3对成肌细胞的分化过程也具有抑制作用[27]。本试验表明过表达circRIPK2后，肌分化标记基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表达水平上调，这证明过表达circRIPK2对成肌细胞的分化具有显著抑制作用。

以上结果表明circRIPK2在骨骼肌生长发育过程中具有调控作用，然而circRIPK2参与骨骼肌调控的具体机制尚未阐释，有待后续进一步探究。

研究表明circRIPK2在细胞核、细胞质中均有表达，其中在细胞质中的占比高于在细胞核中的占比，同时通过在鸡原代成肌细胞过表达circRIPK2检测相关标记基因表达，证实circRIPK2可能通过抑制成肌细胞的增殖，正向调控成肌细胞分化进程，从而参与骨骼肌调控过程。