基于B646L、EP402R、MGF360/505基因的非洲猪瘟病毒ERA检测方法的建立

曾宇晨，龚 浪，王京煜，潘昊鸣，梁杏玲，马 俊，张桂红，王 衡,,3

(1 华南农业大学 兽医学院/广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室，广东 广州 510642；2 国家非洲猪瘟区域实验室(广州)/华南农业大学 非洲猪瘟防控技术研究中心，广东 广州 510642；3 华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心，广东 广州 510642)

非洲猪瘟 (African swine fever)是由非洲猪瘟病毒 (African swine fever virus，ASFV)引起的急性、烈性、高度接触性的传染病。该病毒是一种有囊膜的双链DNA病毒，ASFV基因组大小约为170～190 kb，编码 151～167 个基因[1]。ASFV 中，B646L基因编码的P72蛋白是ASFV的主要衣壳结构蛋白，也是ASFV检测中最常用的靶基因[2]；EP402R基因编码的CD2v蛋白和多基因家族成员MGF360/505基因均能够影响宿主的干扰素产生，且2个基因的缺失是研制非洲猪瘟疫苗的主要方向之一[3-4]。

目前尚无有效的疫苗和药物用于控制非洲猪瘟，只能通过早期检测淘汰来控制疫情的发展。已经建立的检测方法主要包括红细胞吸附试验、PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增(Loopmediated isothermal amplification，LAMP)及酶促重组酶扩增 (Enzymatic recombinase amplification，ERA)等[5]。ERA是一种检测核酸的新技术，通过在模板内添加3种蛋白(DNA重组酶、单链结合蛋白和具有聚合链置换功能的DNA聚合酶)，并加入特异性引物和探针，在一定时间内(15～20 min)完成等温扩增[6]。本研究采用ASFV编码P72蛋白的B646L、编码CD2v蛋白的EP402R和MGF360/505基因作为目的基因模板，通过条件优化，建立用于快速检测ASFV的ERA等温扩增方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)购自苏州先达基因科技有限公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；GenStar 2×Taq PCR StarMix 和Loading Dye购自广州康润生物公司；pMD18-T Vector Cloning 试剂盒购自 Takara 公司；RaPure Viral RNA/DNA试剂盒购自广州美基生物科技有限公司。

1.2 病毒株与临床样品

猪繁殖和呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)的阳性 DNA 或 cDNA 样品均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。15 份ASFV阳性核酸样品由华南农业大学国家非洲猪瘟区域实验室(广州)提供。

1.3 引物和探针设计

根据 GenBank公布的 ASFV GZ201801(GenBank：MT496893.1)病毒基因序列，选取B646L基因(编码p72蛋白)序列、EP402R基因(编码CD2v蛋白)序列和多基因家族成员MGF360/505基因序列的相关片段。根据TwistDX公司给出的指导建议(https://www.twistdx.co.uk/en/support/rpa-assay-design-2)设计ERA引物和探针(表1)，通过BLAST比对确定引物和探针的特异性，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成标记。

1.4 DNA标准模板的制备

以ASFV(GZ201801株)细胞培养悬液为样本，按照RaPure Viral RNA/DNA提取试剂盒说明书，对病毒悬液进行DNA提取。利用构建目的片段的引物(B646L-18t-F/R、EP402R-18t-F/R和MGF-18t-F/R)，使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒，经过PCR后，获得B646L、EP402R和MGF360/505目的基因片段(表1)。PCR 反应体系：2× Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(10 mmol·L−1) 2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，上、下游引物 (10 μmol·L−1)各 2 μL，DNA 样本 2 μL，ddH2O 补足 50 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、61 ℃(B646L)/43 ℃(EP402R)/57 ℃(MGF360/505) 15 s、72 ℃ 1 min(B646L)/1 min(EP402R)/1.5 min(MGF360/505)，35个循环；72 ℃延伸5 min。上述病毒核酸提取及扩增反应体系配置操作均在国家非洲猪瘟区域实验室(广州)所在的华南农业大学生物安全三级实验室完成。将纯化后的目的片段连接至pMD18-T载体后，送至广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。测序正确后，换算为拷贝数。

表 1 ERA探针序列与构建目的片段的引物序列Table 1 ERA probe sequence and primer sequence for constructing target fragment

1.5 ERA方法的引物筛选

以构建的DNA标准质粒为模板，通过PCR获得ERA引物的产物(B646L-ERA-F1/R1、B646LERA-F2/R2和 B646L-ERA-F3/R3，EP402R-ERAF1/R1、EP402R-ERA-F2/R2和 EP402R-ERAF3/R3，MGF-ERA-F1/R1、MGF-ERA-F2/R2 和MGF-ERA-F3/R3)，筛选出试验效果较优引物对。PCR 反应体系：2 × Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物 (10 μmol·L−1)各 0.40 μL，模板 2 μL，ddH2O 补足20 μL。反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、59 ℃(B646L)/62 ℃(EP402R)/56 ℃(MGF360/505) 30 s、72 ℃ 45 s，5个循环；72 ℃延伸5 min。使用常规ERA方法，进行第2次引物筛选，筛选出试验效果较优引物对。ERA反应体系：溶解剂20 μL，上、下游引物(10 μmol·L−1)各 2.10 μL，模板 2 μL，激活剂 2 μL，ddH2O 补足 50 μL。反应程序：37 ℃ 30 min，每 15 s收集FAM荧光信号。

1.6 ERA方法反应体系因素水平设计与优化

参考ERA方法的使用说明[7]，采用L9(33)的正交方法设计方案(表2)。优化ERA体系中的温度、探针浓度、引物浓度、激活剂浓度。经试验得出结果，使用Minitab软件分析得出各因素的最优水平。

表 2 L9(33)试验方案Table 2 L9(33) experimental program

1.7 ERA方法的特异性试验

以PRRSV、CSFV和PRV的DNA或cDNA作为对照，ddH2O为空白对照，使用优化后的ERA方法进行荧光检测，通过观察有无扩增曲线，检测方法的特异性。

1.8 ERA方法的灵敏性试验

将 pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFVEP402R和pMD18T-ASFV-MGF按10倍梯度各稀释至拷贝数为 106、105、104、103、102、101和100μL−1。以各浓度梯度的 pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFVMGF为模板，同时加入ddH2O作为空白对照。使用优化后的ERA方法进行荧光检测，重复3次，检测方法的灵敏性。

1.9 ERA方法的重复性试验

以拷贝数为 105、104和 103μL−1的 pMD18TASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R 和pMD18T-ASFV-MGF为模板，ddH2O作为空白对照。使用优化后的ERA方法进行荧光检测，重复3次，检测方法的重复性。

1.10 ERA方法的临床样本验证检测

以15份ASFV DNA阳性样品和50份DNA阴性样品为模板，使用优化后的ERA方法进行荧光检测，并参照GB/T 18648—2020非洲猪瘟诊断技术标准[8]提供的B646L基因的扩增引物和探针检测样品，将2种方法的结果进行对比分析。

2 结果与分析

2.1 DNA模板的制备

以ASFV GZ201801病毒基因组为模板，B646L-18t-F/R、EP402R-18t-F/R和MGF-18t-F/R为引物，分别扩增获得 1 941、1 087 和 2 559 bp 的特异性片段(图1A～1C)。将扩增片段纯化后，克隆到pMD18-T载体上，进行体外扩增检测得出结果(图1D～1F)并测序正确后，命名为pMD18T-ASFVB646L、pMD18T-ASFV-EP402R和 pMD18TASFV-MGF。测得 pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFVMGF的 DNA 拷贝数分别为4.15×1010、4.67×1010和 4.13×1010μL−1。

图 1 PCR扩增产物结果(A～C)以及质粒鉴定结果(D～F)Fig.1 PCR amplification product results (A−C) and plasmid identification results (D−F)

2.2 ERA方法的引物筛选

将每对ERA引物，分别进行普通PCR，发现每对引物的特异性都很好(图2)。再使用ERA体系，对每对ERA引物进行荧光检测，挑选出最优的1对引物。以反应管内的荧光信号到达设定的阈值(△Rn=5 000)时所经历的循环数 (Cycle number)最低为原则，且荧光值最大为选择标准。分析后，B646L-ERA-F1/R1、EP402R-ERA-F2/R2、MGFERA-F1/R1分别为常规ERA-ASFV-B646L、ERAASFV-EP402R、ERA-ASFV-MGF方法的最优引物对 (图 3)。

图 2 普通PCR对不同引物的检测结果Fig.2 Normal PCR detection results of different primers

图 3 常规ERA对不同引物的检测结果Fig.3 Routine ERA detection results of different primer pairs

2.3 ERA方法条件优化

用最优的1对引物按表2试验方案进行ERA反应，每个组合重复4次，以设定的阈值所经历的循环数最低为原则，记录结果。9组试验结果经过极差分析，得出每个因素的最佳水平，最终列出最佳反应体系。50 μL反应体系中，ERAASFV-B646L：42 ℃，探针 0.48 μL，上、下游引物各 3.15 μL，激活剂 2 μL，溶解剂 20 μL，ddH2O 21.22 μL；ERA-ASFV-EP402R：42 ℃，探针 0.24 μL，上、下游引物各 2.10 μL，激活剂 2 μL，溶解剂 20 μL，ddH2O 23.56 μL；ERA-ASFV-MGF：42 ℃，探针0.48 μL，上、下游引物各 3.15 μL，激活剂 2 μL，溶解剂 20 μL，ddH2O 21.22 μL。

2.4 ERA方法的特异性试验

对PRRSV、CSFV、PRV的DNA或cDNA进行ERA检测，ddH2O为空白对照。结果(图4)显示，该方法对其他3种病毒的DNA或cDNA无特异性扩增，表明该方法具有较强的特异性。

图 4 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的特异性检测Fig.4 The specificity detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods

2.5 ERA方法的灵敏性试验

以拷贝数为 100～106μL−1梯度的 pMD18TASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R 和pMD18T-ASFV-MGF质粒为模板，使用优化过的ERA方法进行检测。结果显示，ERA-ASFVB646L、ERA-ASFV-EP402R和 ERA-ASFVMGF方法检测所用时间分别为16、7和13 min，且对质粒拷贝数的检测限均为 102μL−1(图 5)。

图 5 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的灵敏性检测Fig.5 The sensitivity detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods

2.6 ERA方法的重复性试验

以拷贝数为 105、104和 103μL−1的标准质粒分别作为模板，进行3次ERA扩增反应。结果(表3)显示，标准质粒浓度越高，重复性越好，但所构建的方法不适合非洲猪瘟的定量试验。

表 3 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的重复性检测Table 3 The repeatability detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods

2.7 ERA方法的临床样本验证

采用 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFVEP402R和ERA-ASFV-MGF方法同时检测ASFV 15份阳性核酸样品和50份阴性核酸样品，使用GB/T 18 648—2020 非洲猪瘟诊断技术标准[8]提供的检测方法与之进行比较。结果显示，本试验建立的3种检测方法的检测结果与推荐方法检测结果的符合率为100%。所构建的方法适合非洲猪瘟的定性试验。

3 讨论与结论

目前，我国非洲猪瘟疫情总体可控，大部分猪场正在通过改变传统养殖结构限制非洲猪瘟疫情对养猪行业的影响。在尚无有效的治疗药物和商品化疫苗的情况下，只能通过生物安全配合实验室检测来防控疫情[9-10]。实验室检测方法种类很多，但各有优缺点[11]，ELISA有着操作简单、重复性好等特点，但不适用于ASFV感染的暴发期，且存在假阳性的诊断[12]；LAMP方法具有高特异性、高灵敏性的特点，但获得检测结果至少需要40 min，也易产生假阳性结果[13]。ERA检测方法作为新型分子病原学诊断方法，在37～42 ℃的条件下即可实现核酸扩增，仅需要20 min左右的检测周期，在适合条件下改变试验条件，依然可以保持较高的灵敏度和较强的特异性[14-15]；例如Xia等[16]使用逆转录–酶促重组等温扩增技术(Reverse transcription-enzymatic recombinase amplification，RT-ERA)对新冠病毒(COVID-19)RNA的双基因同时检测，25 min内得出结果，无需特殊设备就可进行简便的居家检测。

目前构建的ERA-ASFV核酸检测方法需要注意以下问题。首先，普通移液枪无法吸取精确体积的黏性溶解剂，导致结果的重复性不是很好；在添加含有溶解剂溶液的过程中，需要使用为吸取黏性液体而设计的移液器。其次，ERA方法反应非常迅速，扩增曲线会在短时间内迅速上升并进入平台期；所以，当加入所有试剂成分后，需要立即检测荧光。另外，目前建立的ERA-ASFV方法只能在病毒检测中作为定性的方法；检测结束后，反应不会自行终止，需要高温灭活试管中的蛋白。

综上所述，本试验建立的ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法特异性强，对应的最低拷贝数检测限均为 102μL−1，分别在16、7和13 min内即可完成反应。参照GB/T 18648—2020非洲猪瘟诊断技术标准[8]推荐方法，经过对比，与推荐检测方法结果一致。本研究结果可为ASFV检测提供一种新方法，并为今后ASFV的ERA多基因检测打下良好技术基础。