猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离和培养及其功能验证

蒋海峰，许 振，张 磊，檀学文，陈维乐，董婷玉，刘潇一，严尚学，常 艳，魏 伟

内皮细胞生理上分泌NO和内皮素(endothelin, ET)等细胞因子，控制血管舒缩及血液中大分子和血细胞的外泄[1]；内皮损伤及功能障碍时，其表达血管细胞黏附分子-1和内源性NO等生物分子导致血管舒缩平衡被打破[2-3]。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)在多种组织中发挥重要功能，病理状态下表达升高，加重多种炎症反应参与疾病的发生发展[4]。冠状动脉为营养心脏的主要血管，其内皮细胞作为与血液接触的直接屏障尤为重要。

目前已有成人、小鼠和猪的冠状动脉原代内皮细胞分离方法，尚未见猕猴相关方法报道[5-7]。与其他动物相比，猕猴表现出与人类遗传、免疫和代谢的高度相似性，是基础研究和临床应用之间一个理想的转化模型[8]。在体外实验中，为更好模拟人体细胞的病理生理状态，探索一种简便可行的猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离方法十分必要。该研究成功建立了猕猴冠状动脉原代内皮细胞的分离培养方法，并对其进行鉴定和功能研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取3～5岁普通级实验猕猴，饲养于安徽医科大学临床药理研究所实验动物中心。温度20～26 ℃；日温差≤4 ℃；相对湿度40%～70%。昼夜交替满足猕猴作息时间，饲料、水和瓜果蔬菜不受限制，定时为猕猴播放音乐及视频。实验动物购自旌德县皖南猕猴驯养繁殖基地，生产许可证号：SCXK(皖)2020-001。该实验过程得到安徽医科大学临床药理研究所动物伦理委员会批准(批号：PT-2020-001)。

1.2 主要试剂冠脉内皮细胞完全培养基购自武汉普赛诺生命科技有限公司；DMEM基础培养基和胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)购自以色列Biological Industries公司；CD31抗体购自美国 Biolegend 公司；CCK-8试剂盒购自广州Biosharp公司；PGE2购自美国Cayman公司；基质胶(Matrigel胶)和Transwell小室均购自美国Corning公司；Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司；舒泰50购自合肥国腾动物保健有限公司。

1.3 主要仪器Cyto FLEX型流式细胞仪：美国Beckman Coulter公司；BD FACSAria分选型流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司；23062型CO2培养箱：美国SHEL LAB公司；Image Xpress Micro4型高内涵细胞成像分析仪：美国Molecular Devcies公司；Infinite M1000 PRO多功能酶标仪：瑞士TECAN公司。

1.4 猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离方法猕猴以6 mg/kg剂量肌肉注射舒泰50麻醉，股动脉放血处死。无菌取出猕猴心脏，并用眼科剪、眼科镊分离冠状动脉前降支和右冠状动脉。将血管移入无菌1.5 ml EP管中剪碎，并用含双抗的生理盐水清洗，4 ℃、4 000 r/min离心5 min弃上清液。加入1 ml 0.1% Ⅱ型胶原酶，于恒温振荡箱37 ℃、200 r/min消化30 min左右，终止消化并离心。用冠状动脉完全培养基重悬组织块，并将其轻轻贴入培养瓶中，加入3 ml冠状动脉完全培养基。将培养瓶竖立在37 ℃、5% CO2培养箱中，4～6 h后轻轻放倒细胞培养瓶进行培养，过程中保持组织块一直呈贴壁状态。

1.5 猕猴冠状动脉原代内皮细胞形态学观察倒置显微镜(DMi1型)观察并拍照记录猕猴冠状动脉原代内皮细胞形态及生长状况。

1.6 猕猴冠状动脉原代内皮细胞传代培养原代细胞培养10～14 d，细胞覆盖培养瓶面积80%左右去除组织块，进行传代。加入胰蛋白酶消化细胞；当细胞皱缩变圆后终止消化。4 ℃，1 500 r/min离心5 min后，用含20% FBS的高糖DMEM培养基(20%培养基)重悬，并1 ∶2进行传代培养。

1.7 猕猴冠状动脉原代内皮细胞纯度检测将消化所得细胞4 ℃、2 500 r/min离心5 min，200 μl PBS重悬，取100 μl细胞悬液孵CD31抗体30 min。离心并加入适量PBS重悬细胞，过滤后流式细胞仪检测内皮细胞比例。

1.8 分选和培养猕猴冠状动脉原代内皮细胞制备细胞悬液，于1.5 ml EP管中孵育CD31抗体40 min，4 ℃、1 500 r/min离心5 min。PBS重悬细胞，经200目纱网过滤放入流式管中，分选型流式细胞仪进行分选。分选后细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.9 猕猴冠状动脉原代内皮细胞功能实验

1.9.1细胞活力和增殖实验

1.9.1.1CCK-8法检测猕猴冠状动脉内皮细胞活力 制备细胞悬液并使用计数板计数，以5×103个/孔铺入96孔板，培养6 h后加0.3 μmol/L PGE2。37 ℃、5%CO2培养箱培养48 h，PBS洗涤细胞。每孔加100 μl 20%培养基、10 μl CCK-8试剂继续培养2～4 h后，以酶标仪检测其吸光度(λ=450 nm)。

1.9.1.2高内涵细胞成像法检测猕猴冠状动脉内皮细胞增殖 细胞制成悬液后，以5×103个/孔细胞接种96孔板，0.3 μmol/L PGE2刺激48 h。PBS清洗细胞，多聚甲醛固定30 min，加DAPI染核7 min，用高内涵成像系统拍照。设定软件参数，检测细胞直径最小到最大范围和细胞荧光最弱到最强范围，减去背景荧光强度，统计分析各组细胞数量。

1.9.2细胞迁移实验 猕猴冠状动脉内皮细胞制成悬液后，接种于24孔板，0.3 μmol/L PGE2刺激48 h。消化细胞铺入24孔板中Transwell小室，下室加20%培养基。培养12 h后将小室放入含0.1%结晶紫的生理盐水，染色15 min；显微镜下观察拍照，每组随机选取9个视野，计数每组视野紫色深染细胞总数。

1.9.3细胞成管实验 内皮细胞接种于24孔板，0.3 μmol/L PGE2刺激48 h后制备细胞悬液；取30 μl Matrigel胶加入4 ℃放置30 min预冷96孔板中，培养箱放置2 h至完全凝胶；以5×103个/孔细胞接种96孔板，培养6 h；倒置生物显微镜(DMi1型)下观察拍照，每组随机选取5个视野，计数每组视野内皮细胞聚集成环的总数。

2 结果

2.1 猕猴冠状动脉原代内皮细胞形态学观察培养第3天组织块周围爬出细胞，到10～14 d组织块周围细胞出现生长接触抑制现象，细胞密度占培养瓶80%左右(图1A)。去除组织块重新铺瓶生长，可见猕猴冠状动脉原代细胞贴壁生长，形态展开，细胞核清晰居中(图1B)。分选后第2天内皮细胞贴壁，多呈扁平多角形，核圆形或椭圆形，形似铺路石状(图1C)。

图1 原代内皮细胞生长状况 ×400A：黏附组织旁原代内皮细胞；B：去除组织后原代内皮细胞；C：分选后原代内皮细胞

2.2 内皮细胞纯度鉴定分选前流式细胞术检测内皮细胞纯度为31.7%左右(图2A、B)。分选后以流式细胞术对内皮细胞进行鉴定，结果显示内皮细胞纯度大于95%(图2C、D)，满足后续实验要求，提示猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离成功。

图2 流式细胞术鉴定内皮细胞纯度A：分选前阴性对照组；B：分选前CD31阳性对照组；C：分选后阴性对照组；D：分选后CD31阳性对照组

2.3 猕猴冠状动脉原代内皮细胞功能实验

2.3.1PGE2对猕猴冠状动脉原代内皮细胞活力以及增殖的影响 CCK-8法检测猕猴冠状动脉原代内皮细胞活力，结果表明PGE2刺激组(PGE2组)较未刺激组(Normal组)内皮细胞活力显著提高(t=-3.948,P=0.017)(图3A)。高内涵成像法检测猕猴冠状动脉原代内皮细胞的增殖能力，结果表明，与未刺激组相比，PGE2刺激组猕猴冠状动脉原代内皮细胞增殖能力显著增强(t=-2.887,P=0.045)(图3B～D)。

图3 PGE2对内皮细胞活力及增殖能力的影响(n=3, ×200)

2.3.2PGE2对猕猴冠状动脉原代内皮细胞迁移的影响 Transwell法检测猕猴冠状动脉原代内皮细胞迁移能力，结果表明，与未刺激组相比，PGE2刺激组猕猴冠状动脉原代内皮细胞迁移数量明显增多，表明PGE2刺激后猕猴冠状动脉原代内皮细胞迁移能力增强(t=-4.251,P=0.013)(图4)。

图4 PGE2对内皮细胞迁移能力的影响(n=3, ×200)

2.3.3PGE2对猕猴冠状动脉原代内皮细胞血管生成的影响 Matrigel胶法6 h检测内皮细胞成管能力良好。由结果可知，与未刺激组相比，PGE2刺激组猕猴冠状动脉原代内皮细胞成管能力显著增强(t=-5.341,P=0.006)(图5)。

图5 PGE2对内皮细胞血管生成的影响(n=3, ×400)

3 讨论

非人灵长类作为人类最亲密的进化亲属，是人类生理和疾病研究的宝贵模型[8]。人类致病基因的高度特异性使得无法利用一些低等动物模型来绘制这些致病基因的图谱[9]，这会导致一些药物向临床转化的失败，使用与人类基因组高度同源的非人灵长类动物猕猴可以提高临床药物研发成功率[8]，提示非人灵长类动物模型和细胞模型的重要性。

冠状动脉是心脏的营养血管，当其发生病变时严重威胁人类生命。川崎病(kawasaki disease, KD)是一种主要影响冠状动脉的全身性血管炎综合征，人冠状动脉内皮细胞经刺激后增殖和成管能力增强，可能参与KD的发病过程[10]；冠状动脉内皮细胞不能充分利用NO适当调节血管舒缩也会诱发冠状动脉疾病[11]。因此，关注冠状动脉内皮细胞有助于了解相关疾病的发生和发展。

目前对不同血管原代内皮细胞提取方法多为酶消化法[12]、组织刮取法[5]、组织黏附法[6]。相较于大血管而言，冠状动脉行走于左右冠状沟内，管径狭小，在许多方法上受到限制。酶消化法难以掌握消化强度；组织刮取法难以掌握刮取力度；组织块黏附法相对简单，但血管打开后难以区分正反面，同时直接黏附细胞爬出缓慢。该研究采用酶消化和组织黏附相结合的方法，同时考虑到细胞生长过程中纯度不够问题，该实验采用了流式细胞术进行分选，以获取高纯度内皮细胞。

CD31即血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1)，是内皮细胞上最丰富的共信号受体蛋白，形成与血液细胞接触的第一线[13]。在细胞分选前后，使用CD31抗体标记，细胞纯度由31.71%左右上升到95%以上，满足实验要求，表明猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离成功。

PGE2属于前列腺素家族，通过结合细胞膜上4个不同的E型前列腺素受体(E-type prostanoid receptor 1～4,EP1～4)发挥作用，在血管内皮细胞上与EP4受体结合诱导其增殖、迁移和成管能力[14]。该实验以PGE2为刺激剂，检测猕猴冠状动脉内皮细胞功能，经刺激后其增殖、迁移和成管能力显著增强，提示猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离成功。

不同器官和血管内皮细胞存在异质性，表现在其形态、生理和表型差异等[1]。对冠状动脉、静脉和冠状动脉微血管分离出来的内皮细胞对比研究表明，前列腺素合成能力存在区域差异[15]。若要进一步揭示动脉粥样硬化、冠心病等好发于冠状动脉的疾病发病机制，冠状动脉内皮细胞是很好的体外细胞模型。该实验以猕猴为实验动物成功探索出非人灵长类冠状动脉原代内皮细胞分离方法，并对内皮细胞的功能进行了鉴定，为研究冠状动脉相关疾病提供了一个体外细胞模型。